芸薹根肿菌(Plasmodiophora brassicae Wor.)引起的十字花科植物根肿病在世界范围内发生和为害。近年来,根肿病已由长江上游扩散至长江中下游油菜产区,严重威胁我国油菜产业的安全,需要研制安全、高效和绿色的防控措施。本文研究了根肿菌寄主(拟南芥)应答病原菌侵染早期反应机制,研究了根肿菌、寄主与根部内生微生物之间的交互作用。取得阶段性研究进展如下:采用RNA-Seq技术研究了拟南芥对根肿菌侵染早期应答机制,建立了拟南芥应答根肿菌侵染早期(病原菌吸附根毛和侵染阶段)的数字基因表达谱,分析了在接种24 hpi和48 hpi与接种前相比差异表达的基因,其中24 hpi时拟南芥有536个基因上调表达,1367个基因下调表达;48 hpi时有374个基因上调表达,985个基因下调表达。通过Gene Ontology和Pathway富集分析对差异表达基因在不同功能模块和通路中的分布进行了分析,并通过MAPMAN将通路变化进行了深入展示分析。结果显示在根肿菌侵染早期(24 hpi和48 hpi),拟南芥中与类黄酮和木质素合成通路显著的增强;芥子油甙、帖类物质和原花青素等物质代谢产物合成增多;生长素、细胞分裂素、水杨酸和茉莉酸等激素及受体激酶相关基因表达增强。另外,受到根肿菌侵染后,拟南芥与豆科植物和根瘤菌共生过程中早期结瘤素基因同源的基因上调表达。拟南芥的这些应答反应说明病原菌在根肿菌侵染早期阶段与寄主发生了重要的相互作用,为病原菌皮层侵染和在寄主皮层细胞内生长和繁殖奠定了物质基础。根据目前研究报道,根瘤菌只能与豆科植物及少数榆科植物共生固氮,丛枝菌根真菌(AM真菌)可以和约80%的陆生植物形成互惠共生关系。根瘤菌和AM真菌在共生早期存在类似的信号通路,同时它们在自然状态下都不能侵染十字花科植物。根瘤菌和AM真菌均从寄主植物根毛侵入,且该过程与植物生长素、细胞分裂素和类黄酮等激素相关,考虑到根肿菌根毛侵染阶段同样可以激活激素和类黄酮合成途径,推定根瘤菌和AM真菌可能会进入罹患根肿病的油菜根部。对自然发病田块的油菜病根进行了PCR检测和原位杂交检测,发现病根中根瘤菌的存在。在室内同时接种根瘤菌和根肿菌,并采用PCR检测、荧光原位杂交、荧光观察带标记的根瘤菌、扫描电镜观察和组织分离根瘤菌等方法进行了验证,进一步证实了根瘤菌可以与根肿菌同定殖于油菜皮层细胞中。根瘤菌与根肿菌共侵染油菜后可以减轻根肿病的症状,更有趣的是通过氮素测定、同位素稀释和固氮酶活测定方法检测到根瘤菌在共侵染的油菜中可能存在一定的固氮活性。在接种根肿菌后(48 hpi),油菜可以合成和分泌多种类黄酮物质,根分泌物可以促进根瘤菌Nod D基因的表达,同时通过检测接种根肿菌早期拟南芥中与豆科植物与根瘤菌侵染、共生相关基因的序列同源基因的表达量明显增强。此外,在油菜中共接种AM真菌和根肿菌,PCR检测、WGA染色观察和实时定量分析等证实AM真菌可以在共接种油菜的根部皮层细胞间隙生长,并在皮层细胞中形成类似丛枝的结构。油菜在感染根肿菌后,根瘤菌和AM真菌可以进入其根部并在细胞定殖,这预示根肿菌侵染后油菜根部环境可能会适合其它微生物生长。在田间采集罹病油菜样品时也常发现田间存在少量的携带病原菌但不显现症状的植株。推定未显症植株的根部内生性微生物可能会对根肿菌有显著的抑制作用。因此利用16S rRNA和ITS高通量测序技术对油菜根肿病罹病植株的根部内生微生物组进行了测定,发现在未显症油菜样品和显症样品中均可以检测出大量的微生物;在未显症植株中微生物的种类和含量明显的高于显症植株中的含量;在未显症的植株中特有和含量明显高于未显症的微生物中存在很多具有植物病害生物防治和促进植物生长等功能的微生物以及一些其他的植物病原微生物;此外,在显症和未显症的样品中都检测到了根瘤菌目细菌和菌根真菌,在未显症样品中检测到一个特异存在的AM真菌属。本研究证明了拟南芥和根肿菌在早期侵染阶段的相互作用在根肿菌的整个生活史中起到了重要的作用;同时根肿菌在早期侵染阶段引起寄主的激素合成途径和次生代谢途径等的变化,而可能因为这些途径的改变,引发了根瘤菌和AM真菌两种互惠共生微生物进入它们的非寄主植物(油菜);微生物组分析结果表明感染根肿菌但未显症的油菜根部内生微生物组与显症植株的微生物组存在显著差异。本文的发现可望为深入研究根肿菌与寄主植物互作机制,为研究油菜、根肿菌与油菜根部内生微生物组互作及挖掘抗根肿病的生物防治资源等奠定基础;同时本研究为根瘤菌和AM真菌与非寄主植物(如油菜)互惠共生研究提供新的思路。