论文部分内容阅读
[背景]椎间盘(Intervertebral Disc, IVD)是脊柱运动功能单位中关键的结构。因椎间盘退变而导致的椎间盘退变性疾病(Degenerative Disc Disease, DDD)已成为现代社会中严重影响人们生活质量的常见病。椎间盘退变是一个复杂的过程。引起椎间盘退变的原因是多方面、多层次的,生物力学改变、外伤、营养障碍、炎症反应、基质降解酶类的激活、生长因子改变、细胞凋亡、遗传等等众多因素可能都是导致椎间盘退变的原因。近年一些研究者认为抑制了椎间盘细胞的凋亡就能阻止椎间盘退变的进程。炎症因子在椎间盘的退变过程中起了很大的促进作用。已报道的在椎间盘中可检测到的炎性因子主要有IL-1β、IL16、IL6、IL8、IL-1a、IL12和TNF-a等。最近研究还发现,IL-1β对椎间盘细胞的凋亡也有影响。然而,IL-1β对椎间盘细胞的凋亡作用途径尚不清楚。明确椎间盘细胞的具体凋亡途径对于选择阻断这种过度凋亡的合适方法有着要重要的意义。研究IL-1β对诱导人髓核细胞的凋亡的过程或许能为研究椎间盘退变性疾病提供些思路。[目的]本实验的目的是以体外培养腰椎间盘退变性疾病病人的髓核细胞为研究对象,摸索并比较IL-1β、IL-1a、IL-6对腰椎间盘髓核细胞的作用,尤其是IL-1β的诱导凋亡作用随浓度和作用时间的变化,并证实IL-1β对人髓核细胞具有诱导凋亡作用。[材料和方法]取腰椎间盘退变性疾病病人的髓核细胞体外培养,(1)采用酶消化法分离人椎间盘髓核细胞,进行单层培养,观察其形态结构和生物学特性,通过免疫细胞化学对细胞表型进行鉴定；(2)应用Cell Counting Kit-8试剂盒观察IL-1β在Ong/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL浓度分别刺激0h、24h、48h、72h后对髓核细胞凋亡的影响,并与类似条件下的IL-1a、IL-6作用相比较；(3)分别采用Annexin V-FITC、碘化丙啶双重荧光素染色和线粒体膜电位检测技术观察髓核细胞的凋亡,并用流式细胞技术统计凋亡率。用western blot方法检测cleaved caspase-3的表达。[结果](1)成功进行人髓核细胞单层培养,细胞形态为多角形；细胞具有Ⅱ型胶原的阳性表达。(2)在无血清的条件下,50ng/mL IL-1β即可对髓核细胞表现出明显的毒性作用,在48h时毒性作用表现已做够明显,IL-1a、IL-6未观察到明显类似作用,10%的胎牛血清对IL-1β有抑制作用。(3)可观察到IL-1β导致的人髓核细胞明显凋亡；可观察到实验组中cleaved capase3的表达,对照组阴性。[结论](1)成功培养人退变椎间盘髓核细胞,表型鉴定符合髓核细胞特征。(2)采用Cell Counting Kit-8试剂盒观察到在无血清条件下IL-1β在一定浓度下即可对髓核细胞表现出明显的毒性作用,IL-la、IL-6无明显类似作用,10%的胎牛血清对IL-1β有抑制作用。(3)运用Annexin V-FITC、碘化丙啶双重荧光素染色和线粒体膜电位检测技术观察IL-1β作用下的髓核细胞的凋亡,并用流式细胞技术统计凋亡率。(4)通过Western blot检测到IL-1β作用下的人髓核细胞caspase-3的活化,证实其诱导调往的作用。