附子、川乌和草乌（以下简称附子类）均为含乌头碱类的有毒中药，生品毒性很大，致死的主要原因是严重的心律失常，故多经加工炮制减毒后用于临床。附子类药材中乌头碱、中乌头碱和次乌头碱等双酯型生物碱是其主要的毒性成分，也是这类药材回阳救逆、温中止痛的主要活性成分。其心脏毒性机制多认为是促使心肌细胞Na⁺通道开放，加速Na⁺内流，促使细胞去极化，从而导致心律失常。附子类药材的毒性与产地、品种、炮制方法有关。本课题组其他研究表明不同产地的附子指纹图谱的相似度差异较大，表明附子类药材中生物碱的含量差异大，因而对本类药材的毒性影响亦很大。炮制亦是附子类药材减毒的主要方式，从汉代张仲景的《金匮要略》出现乌头的炮制方法起，演变至今已有约70多种炮制方法，有浸制、煮制、蒸制、甘草制、蜜制、醋制、豆腐制、黑豆制、甘草白矾制、甘草皂角制、甘草银花制等。现代又提出了盐煮法、高压蒸法、热烘法等。附子类药材在炮制过程中双酯二萜类生物碱的酯键水解，失去乙酰基生成单酯二萜类生物碱（如苯甲酰乌头碱），再继续水解失去苯甲酰基生成乌头原碱（aconine）。水解后水解产物毒性显著下降，苯甲酰乌头碱毒性约为乌头碱的1／200，而乌头原碱毒性仅为乌头碱的1／2000。此外在炮制过程中，脂肪酰基取代了双酯二萜类生物碱C₈-OH上的乙酰基而生成脂碱，也可降低附子类药材的毒性。由此可见炮制可明显降低附子类药材中双酯型生物碱的含量，从而达到减毒的作用。历代医家对附子类药材炮制目的的认识基本上可分为减毒和增效两方面。而目前的炮制研究和饮片生产主要关注的是减毒，对于增效（存效）则不太重视。现行的乌头炮制方法为了降低毒性，采用的是先漂和浸，使部分剧毒的双酯型生物碱流失；再进行蒸或煮，使其水解成毒性较低的单酯型生物碱和胺醇型生物碱的方法。而附子类药材中双酯型生物碱成分既是有毒成分，同时又是其回阳救逆、抗炎、镇痛的有效成分。故双酯型生物碱的含量不仅与附子类药材毒性的大小关系密切，而且与其药效的强弱密切相关。通过生物实验确定双酯型生物碱含量与其药效和毒性的关系，对规范含乌头碱类中药炮制工艺有着重要的指导意义。本研究从三种双酯型生物碱的心脏毒性与强心作用的入手，观察比较三种双酯型生物碱量-效、量-毒关系及其安全范围，为含乌头碱类中药炮制的改进提供实验依据。配伍是中医组方遣药特色之一，在“七情合和”与“君臣佐使”的理论指导下，历代医家在使用附子的过程中通过与不同药物的配伍，或解其毒，或增其效。如《食疗本草》有云：“黑豆煮食之，杀乌头、附子毒。”《本草经集注》云：“俗方每用附子，须甘草、人参、生姜相配者，正制其毒故也。”故传统配伍方法包括以甘缓毒、以收约散，以寒制热、以柔克刚，经常与附子配伍的药材有甘草、干姜、大黄、地黄、芍药、防己等。其中历代医家用附子多配伍甘草，因而甘草在含有附子类药材的方剂中应用最为广泛。“用甘草盖以附子之性急得甘草而后缓，附子之性毒得甘草而后解，附子之性走得甘草而后益心脾，附子之性散得甘草而后调营卫”（《景岳全书》）。即甘草与附子相伍既温养阳气，调中补虚，加强附子回阳救逆作用；又补偏救弊，缓和药性。甘草是中医临床使用最多的药材之一。甘草化学成分主要有甘草三萜皂苷类、甘草黄酮类、甘草多糖类等。甘草与附子配伍减毒机理的研究多是集中于不同化学成分间的相互作用，认为甘草酸在体内的水解产物葡萄糖醛酸能与乌头类生物碱的羟基结合，生成低毒或无毒的葡萄糖醛酸络合物而由尿排出。甘草黄酮类成分与酯型生物碱生成沉淀，从而降低药液中酯型生物碱含量，起到降低附子毒性的作用。此外，有文献报道甘草对抗乌头碱所致心律失常的主要成分为甘草黄酮类成分，而甘草中的黄酮类主要是以二氢黄酮类（如甘草苷）和查尔酮类（如异甘草苷）化合物为主。且甘草苷对抗乌头碱的作用未见报道。因此，本研究从甘草苷入手，运用现代技术手段，从生物效应的角度研究附子、甘草配伍对附子毒效成分生物作用发挥的影响及减毒增效的机制。本研究的成果对揭示中医理论，指导临床用药有着现实的意义。本研究，首先从整体、器官、细胞水平分析比较了三种双酯型生物碱（乌头碱、中乌头碱和次乌头碱）的量-时-毒关系及其对心功能的影响。在此基础上研究了甘草苷对心功能的影响及甘草苷对乌头碱心脏毒性的对抗作用和甘草苷对乌头碱强心作用的影响；并进一步利用全细胞膜片钳技术试图从离子通道水平分析甘草苷对乌头碱心脏作用的影响。实验结果如下：一、附子中三种双酯型生物碱的心脏毒性及强心作用1附子中三种双酯型生物碱的心脏毒性1．1附子中三种双酯型生物碱对在体大鼠心脏的毒性作用以大鼠Ⅱ导联心电图变化为指标，采用Medlab生理信号记录系统，经大鼠股静脉缓慢恒速推注三种双酯型生物碱，动态观察比较乌头碱、中乌头碱、次乌头碱对心脏的毒性作用。结果表明附子中双酯型生物碱具有明显的心脏毒性，乌头碱持续缓慢恒速静脉注射后，累计给药剂量为17.5μg·kg^-1、42.8μg·kg^-1、80.8μg·kg^-1、84.5μg·kg^-1、106.7μg·kg^-1，中乌头碱持续缓慢恒速静脉注射后，累计给药剂量为18.1μg·kg^-1、25.9μg·kg^-1、158.2μg·kg^-1、148.0μg·kg^-1、265.3μg·kg^-1，次乌头碱持续缓慢恒速静脉注射后，累计给药剂量为60.0μg·kg^-1、134.1μg·kg^-1、2571.4μg·kg^-1、4182.3μg·kg^-1、6177.4μg·kg^-1时依次出现室性早搏（PVC）、室性心动过速（VT）、心室扑动（VFL）、心室纤颤（VF）直至停搏（CA）动物死亡。其中次乌头碱出现VFL、VF、CA的累计剂量明显高于乌头碱、中乌头碱（与乌头碱、中乌头碱组相比较p＜0.01）。1．2附子中三种双酯型生物碱对离体大鼠心脏毒性作用采用离体大鼠心脏Langendorff灌注法，用微量注射泵由离体心脏主动脉基部分别随灌注液缓慢注射乌头碱等三种双酯型生物碱，观察比较乌头碱、中乌头碱、次乌头碱对离体心脏的毒性作用。结果可见：附子中双酯型生物碱具有明显的心脏毒性，持续缓慢灌注后，乌头碱、中乌头碱、次乌头碱累计灌注量分别为18.3μg、21.0μg、226.7μg时出现CA，其中次乌头碱的累计灌注量最大（与乌头碱、中乌头碱组相比较p＜0.01）。1．3附子中三种双酯型生物碱对乳鼠心肌细胞的时-毒关系、量-毒关系研究以细胞活力、乳酸脱氢酶活力（LDH）为指标，观察比较乌头碱、中乌头碱、次乌头碱毒时效关系。结果可见随乌头碱、中乌头碱、次乌头碱浓度的提高（乌头碱、中乌头碱终浓度依次为0.5μM、2μM、8μM、32μM，次乌头碱终浓度依次为1μM、4μM、16μM、64μM）、孵育时间的延长（30min、60min、120min）心肌细胞活力明显降低，培养液中乳酸脱氢酶活力明显升高。其中细胞活力降低10％～50％，LDH活力升高5～10倍（与对照组相比较p＜0.05，p＜0.01）。2附子中三种双酯型生物碱对心功能的影响2．1附子中三种双酯型生物碱对尼莫地平致心衰大鼠左心功能的影响本实验选用钙离子拮抗剂尼莫地平复制大鼠心衰模型，采用Medlab生理信号记录系统，经大鼠股静脉恒速缓慢推注三种双酯型生物碱，动态观察比较随累计给药剂量的增加乌头碱、中乌头碱、次乌头碱的强心作用。结果表明，随乌头碱、中乌头碱给药剂量的增加，模型动物的心率明显加快（最高分别增加24％、35％）、心室收缩期明显缩短（最高分别缩短38％、45％）（与模型组相比较p＜0.05，p＜0.01）；心肌收缩性能亦明显增强，表现为+dp／dtmax，Vmax，LVDP，LVSP、RPP明显升高（与模型组相比较p＜0.01）。其中乌头碱、中乌头碱累计给药在1.67μg～10μg时+dp／dtmax最高分别增加32％、21％，Vmax最高分别增加100％、45％，LVDP最高分别增加36％、30％，RPP最高分别增加34％、38％。次乌头碱作用亦与乌头碱相似，累计给药在3.33μg～20μg时心率增加8.5％，心室收缩期最高缩短10.3％，+dp／dtmax最高增加30％，Vmax最高增加67％，LVDP最高增加13％，RPP最高增加17％。三种双酯型生物碱均可明显降低LVEDP（与模型组相比较p＜0.05，p＜0.01），但对-dp／dtmax作用较弱。2．2附子中三种双酯型生物碱对离体大鼠心脏左心功能的影响采用离体大鼠心脏Langendorff灌注法和Medlab生理信号记录系统，用微量注射泵由主动脉基部分别随灌注液恒速缓慢注射乌头碱等三种双酯型生物碱，动态观察三种双酯型生物碱对离体大鼠心脏的作用。结果可见：使用乌头碱、中乌头碱灌注后，随累计灌注量的增加心率呈逐渐上升趋势（与对照组相比较p＜0.05）。其中乌头碱、中乌头碱在累计灌注量为11.67μg时，心率分别增加98％、40％。而次乌头碱，随累计灌注量的增加心率明显降低（与对照组相比较p＜0.05，p＜0.01），在累计灌注量为40μg、46.67μg时，心率分别降低66％。乌头碱在累计灌注量5μg、中乌头碱在累计灌注量6.67μg时，可明显升高+dp／dtmax（与对照组相比较p＜0.05），分别增加14.9％、23.2％，但随后逐渐降低。中乌头碱、次乌头碱随累计灌注量的增加-dp／dtmax呈逐渐上升趋势。3附子中三种双酯型生物碱对心脏作用的治疗指数将实验1．1（附子中三种双酯型生物碱对在体大鼠心脏的毒性作用结果）的原始数据，按每例动物的实验结果作柱状图，随机截取不同给药剂量，计算在该剂量时出现毒性反应（PVC、VT、VF、VFL、CA）的阳性率，用Bliss法计算相应毒性反应的半数致死量。乌头碱、中乌头碱、次乌头碱的LD₅₀分别为334μg·kg^-1、271μg·kg^-1、921μg·kg^-1。将实验2．1（附子中三种双酯型生物碱对在体大鼠心脏的毒性作用）结果的原始数据，分别计算各例动物的RPP、+dp／dtmax造模前后各时间点的变化率，选择最大值作为最大效应量，用Bliss法计算50％最大效应量(ED₅₀)。计算各例ED₅₀的均值，标准差。以RPP变化率为指标计算，乌头碱、中乌头碱、次乌头碱的ED₅₀分别为5.69μg·kg^-1、3.58μg·kg^-1、7.24μg·kg^-1。以+dp／dtmax为指标计算，乌头碱、中乌头碱、次乌头碱的ED₅₀分别为8.49μg·kg^-1、7.65μg·kg^-1、18.09μg·kg^-1。以LD₅₀／ED₅₀（分别以RPP、+dp／dtmax为指标）计算三种双酯型生物碱对心脏作用的治疗指数（TI）。结果表明以RPP为指标计算TI，乌头碱、中乌头碱、次乌头碱分别为58.73、60.62、127.19，以+dp／dtmax为指标计算TI，乌头碱、中乌头碱、次乌头碱分别为39.34、28.37、50.92。综上所述，乌头碱、中乌头碱、次乌头碱具有明显的心脏毒性，也具有明显改善心功能的作用。在三种双酯型生物碱中次乌头碱的毒性较弱，治疗指数最大，可作为评价附子类中药材炮制标准之一。二、甘草苷与乌头碱配伍对乌头碱心脏毒性及强心作用的影响及机制分析1甘草苷与乌头碱配伍对乌头碱毒性的影响1．1甘草苷与乌头碱配伍对乌头碱小鼠毒性的影响以小鼠存活率为指标，采用尾静脉先后注射甘草苷、乌头碱的方法，观察不同剂量的甘草苷对乌头碱毒性的对抗作用。结果表明，使用甘草苷后，呈剂量依赖性部分对抗乌头碱的毒性，提高机体对乌头碱的耐受力，甘草苷6 mg·kg^-1、3 mg·kg^-1、1.5 mg·kg^-1使乌头碱0.4 mg·kg^-1的死亡率分别降低55％、30％、10％，其中甘草苷6 mg·kg^-1、3 mg·kg^-1作用明显（与乌头碱组相比较p＜0.05，p＜0.01）。1．2甘草苷与乌头碱配伍对乌头碱大鼠心脏毒性的影响以大鼠Ⅱ导联心电图变化为指标，采用Medlab生理信号记录系统，经大鼠股静脉缓慢恒速推注乌头碱，动态观察比较乌头碱及不同剂量的甘草苷对乌头碱心脏毒性的对抗作用。结果表明，甘草苷可明显提高大鼠对乌头碱的耐受量，延缓VF、VFL、CA等心脏毒性反应的出现，但对乌头碱引起的PVC、VT的对抗作用不明显。其中乌头碱累计给药剂量为17.5μg·kg^-1、42.8μg·kg^-1、80.8μg·kg^-1、84.5μg·kg^-1、106.7μg·kg^-1时依次出现PVC、VT、VF、VFL直至CA动物死亡。甘草苷3mg·kg^-1可使乌头碱产生相应的心脏毒性的剂量分别提高1.7％、55.8％、930.2％、930.4％、845.9％，甘草苷1.5mg·kg^-1分别提高46.9％、110.0％、285.4％、365.3％、458.8％，甘草苷0.75mg·kg^-1分别提高12.6％、0.9％、274.8％、301.9％、319.0％。1．3甘草苷与乌头碱配伍对乌头碱离体大鼠心脏毒性的影响采用离体大鼠心脏Langendorff灌注法，用微量注射泵由主动脉基部分别随灌注液缓慢注射乌头碱及甘草苷，观察比较及不同浓度的甘草苷对乌头碱对离体大鼠心脏毒性的拮抗作用。结果表明，乌头碱累计灌注量为18.3μg时，离体心脏停搏；甘草苷以80、40、20μg／h的速度灌注可使大鼠离体心脏对乌头碱的耐受量分别提高342.1％、198.4％、177.6％，减缓停搏反应的出现（与乌头碱组相比较p＜0.05，p＜0.01）。1．4甘草苷与乌头碱对乳鼠心肌细胞的细胞活力、细胞膜通透性、钠钾ATP酶、钙镁ATP酶的影响以细胞活力、LDH活力，钠钾ATP酶、钙镁ATP酶活性为指标观察不同浓度的甘草苷对乌头碱毒性的影响。结果可见：乌头碱终浓度为8gM对乳鼠心肌细胞的活力有一定的抑制作用，细胞活力为对照组的79.4％（与对照组相比较p＜0.05），而甘草苷终浓度为64μM对心肌细胞活力的抑制作用不明显，细胞活力为对照组的90％。但两者按一定比例混合后（乌头碱：甘草苷分别为8μM：1μM、8μM：4μM、8μM：8μM、8μM：16μM、8μM：64μM），对心肌细胞活力的抑制作用增强（细胞活力分别为对照组的63.3％、64％、64.3％、73.6％、85.7％，与对照组相比较p＜0.05，p＜0.01），并与甘草苷所占比例的增加呈正相关。乌头碱终浓度为8μM、甘草苷终浓度为64μM对乳鼠心肌细胞细胞膜的通透性有明显增强作用，使培养液中LDH活力分别升高570.1％、558.4％（与对照组相比较p＜0.05），提示两者对心肌细胞具有一定的损伤作用。但两者按一定比例混合后（乌头碱：甘草苷分别为8μM：1μM、8μM：4μM、8μM：8μM、8μM：16μM、8μM：64μM），此作用与乌头碱组、甘草苷组相比较未见明显增强（LDH活力分别升高499.3％、511.3％、533.9％、545.6％、601.1％，与对照组相比较p＜0.05，p＜0.01）。乌头碱8μM、甘草苷16μM孵育1小时对乳鼠心肌细胞细胞膜Na⁺-K⁺ATP酶、Ca²⁺-Mg²⁺ATP酶活性的影响不显著，但两者按乌头碱8μM、甘草苷16μM比例混合后，可明显增强乳鼠心肌细胞细胞膜Na⁺-K⁺ATP酶活性，使其提高约114.4％（与对照组相比较p＜0.05）。2甘草苷与乌头碱配伍对乌头碱强心作用的影响2．1甘草苷与乌头碱配伍对尼莫地平致心衰大鼠强心作用的影响本实验选用钙离子拮抗剂尼莫地平复制大鼠心衰模型，采用Medlab生理信号记录系统，经大鼠股静脉分别缓慢恒速推注乌头碱，动态观察比较不同剂量甘草苷提前给药对乌头碱及强心作用的影响。结果表明，使用尼莫地平后模型动物的心功能各项指标有了明显的改变表现为+dp／dtmax、-dp／dtmax、Vmax、LVSP、LVDP明显降低，心率的明显减慢，心室收缩期、心室舒张期均明显延长（与对照组相比较P＜0.05，P＜0.01）乌头碱组随累计乌头碱给药量的增加，心功能各项指标明显改善，表现为+dp／dtmax、Vmax、Vpm、LVDP、RPP明显升高，心率的加快，心室收缩期明显缩短（与模型组相比较p＜0.05，p＜0.01）。甘草苷随给药剂量的增加可明显抑制模型动物心率的降低（与模型组相比较p＜0.05，p＜0.01），但甘草苷提前给药可抑制乌头碱所致的模型动物心率的增加（与乌头碱组相比较p＜0.05）。甘草苷组及甘草苷+乌头碱各剂量组，随累计给药量的增加，心肌收缩性能明显增强，表现为+dp／dtmax、Vmax、Vpm、LVDP明显升高，抑制模型动物-dp／dtmax、RPP的降低，降低LVEDP，抑制模型动物心室收缩期的延长（与模型组相比较p＜0.05，p＜0.01）。甘草苷3mg·kg^-1提前给药可明显增强乌头碱对+dp／dtmax、Vmax、LVDP、RPP的作用，对左心心室收缩期的缩短的趋势，（与乌头碱组相比较p＜0.05，p＜0.01），但对Vpm作用不明显。甘草苷1.5 mg·kg^-1、0.75mg·kg^-1提前给药对乌头碱的强心作用无明显影响。综上所述：乌头碱、甘草苷均可改善心肌收缩功能，增加心率，增加心肌耗氧量；甘草苷3mg·kg^-1的强心作用与乌头碱的强心作用协同作用。2．2甘草苷与乌头碱配伍对离体大鼠心脏功能的影响采用离体大鼠心脏Langendorff灌注法和Medlab生理信号记录系统，用微量注射泵由主动脉基部分别随灌注液缓慢注射乌头碱及甘草苷，对观察甘草苷对乌头碱对离体大鼠心脏作用的影响。结果表明：甘草苷80μg／h灌注可增强乌头碱升高+dp／dtmax、-dp／dtmax的作用，使乌头碱+dp／dtmax、-dp／dtmax的最大增加百分率分别升高73.8％、160.4％，使乌头碱的作用强度增强（与乌头碱组相比较p＜0.05），作用时间延长。3甘草苷与乌头碱配伍对乌头碱安全范围的影响将实验1．2（甘草苷对乌头碱致大鼠心脏毒性的对抗作用）的原始数据，按每例动物的实验结果作柱状图，随机截取不同给药剂量，计算在该剂量时出现毒性反应（PVC、VT、VF、VFL、CA）的阳性率，用Bliss法计算相应毒性反应的TD₅₀、LD₅₀。乌头碱的LD₅₀为334μg·kg^-1，而使用甘草苷3μg·kg^-1、1.5μg·kg^-1、0.75mg·kg^-1后乌头碱的LD₅₀分别为1041μg·kg^-1、440μg·kg^-1、386μg·kg^-1；而乌头碱引起VF、VFL的半数中毒量明显提高，且甘草苷剂量越大作用越明显，其中甘草苷3mg·kg^-1可使乌头碱引起VF、VFL的TD₅₀分别增加约5倍、7倍；甘草苷1.5mg·kg^-1可使乌头碱引起VF、VFL的TD₅₀、LD₅₀分别增加约3.5倍、4倍，甘草苷0.75mg·kg^-1可使乌头碱引起VF、VFL的TD₅₀分别增加约2.5倍、3.5倍。但对PVC、VT的发生无明显影响。将实验2．1（甘草苷与乌头碱配伍对尼莫地平致心衰大鼠强心作用的影响）的原始数据，分别计算各例动物的RPP、+dp／dtmax造模前后各时间点的变化率，选择最大值作为最大效应量，用DAS软件计算ED₅₀。以RPP、+dp／dtmax变化率为指标计算的乌头碱的ED₅₀分别为5.69μg·kg^-1、8.49μg·kg^-1。而使用甘草苷3 mg·kg^-1、1.5 mg·kg^-1、0.75mg·kg^-1后乌头碱的ED₅₀分别为14.51μg·kg^-1、7.26μg·kg^-1、7.36μg·kg^-1和12.91μg·kg^-1、7.79μg·kg^-1、9.70μg·kg^-1。以+dp／dtmax变化率为指标计算乌头碱对心脏作用的TI，乌头碱为39.34，而使用甘草苷3 mg·kg^-1、1.5 mg·kg^-1、0.75mg·kg^-1后乌头碱的TI分别为80.59、56.45、40.10；以RPP变化率为指标计算TI，乌头碱为58.73，而使用甘草苷3 mg·kg^-1、1.5 mg·kg^-1、0.75mg·kg^-1后乌头碱的TI分别为71.68、60.35、52.88。4、甘草苷、乌头碱对豚鼠心肌细胞离子通道的影响应用膜片钳技术观察乌头碱、甘草苷对心肌钠离子通道及L-钙离子通道的影响。结果表明乌头碱可使豚鼠心肌细胞钠离子电流增强，抑制L-钙离子通道。甘草苷可抑制心肌细胞钠电流增强，但对L-钙离子通道作用不明显。结语：乌头碱、中乌头碱、次乌头碱具有明显的心脏毒性，也具有明显改善心功能的作用。在三种双酯型生物碱中次乌头碱的毒性较弱，治疗指数最大。甘草苷与乌头碱配伍可降低乌头碱的心脏毒性，并与乌头碱的强心作用有协同作用，使乌头碱对心脏作用的安全范围扩大。甘草苷与乌头碱配伍减毒增效（存效）的作用机制与其抑制心肌细胞钠离子通道的作用有关。本研究的创新点1、本研究首次动态观察了附子中三种双酯型生物碱的量-效，量-毒关系，比较了乌头碱、中乌头碱、次乌头碱对心脏毒性的TD₅₀，强心作用的ED₅₀，及其对心脏作用的治疗指数的大小。2、本研究首次确定甘草中黄酮类成分甘草苷具有对抗乌头碱毒性的作用。并从生物效应的角度提供了实验依据。为中药甘草、附子配伍解毒增效的理论提供了新的实验依据。3、本研究首次从心肌细胞膜离子通道的角度研究了甘草苷对抗乌头碱毒性的机制。