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背景:丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge）作为一种传统的中药被广泛用于治疗多种疾病,如心血管疾病、脑血管性疾病、癌症以及免疫系统疾病。丹参的主要有效成分包括丹参酮IIA（Tanshinone IIA,TNA）、异隐丹参酮（Isocryptotanshinone,ICT）、二氢丹参酮Ⅰ（Dihydrotanshinone I,DHT）、隐丹参酮（Cryptotanshinone）、甲基丹参酮（Methyltanshinone）等,在动物模型和临床上丹参及其主要成分均有抗炎作用。NLRP3炎症小体活化介导的白介素-1β（IL-1β）成熟和分泌在机体免疫反应和疾病发生过程中具有重要作用,抑制NLRP3炎症小体活化可能是改善治疗这些炎症疾病的一种策略。为了探讨丹参酮类化合物是否能够抑制NLRP3炎症小体活化,我们收集了15个丹参酮类化合物,发现该类化合物均能有效地抑制NLRP3炎症小体依赖的IL-1β释放。在本论文中,我们将进一步研究丹参酮类化合物抑制NLRP3炎症小体活化机制,并在相关炎症动物模型中探索其药效。目的:本研究旨在探讨丹参酮类化合物抑制NLRP3炎症小体活化的作用机制以及其在相关炎症动物模型中的药效。方法:第一部分:在巨噬细胞中,用LPS/Nigericin和LPS/ATP两种方式激活NLRP3炎症小体构建细胞模型;在J774A.1细胞中,用LPS/Nigericin激活NLRP3炎症小体,ELISA实验检测15个丹参酮类化合物对IL-1β分泌的影响;用CCK-8试剂检测15个丹参酮类化合物处理J774A.1细胞24 h的毒性,选择DHT、ICT和TNA三个化合物作为代表进行药理机制研究。（1）采用CCK-8试剂检测处理J774A.1细胞2 h或24 h的细胞毒性。（2）在巨噬细胞中,用LPS/Nigericin和LPS/ATP两种方式激活NLRP3炎症小体,ELISA试剂盒检测处理后细胞上清液中IL-1β分泌的影响;蛋白免疫印迹实验检测处理后细胞上清液中IL-1β和Caspase-1（P20）以及细胞裂解液中NLRP3、Pro-IL-1β、Pro-Caspase-1和ASC蛋白的表达;LDH试剂盒检测对细胞死亡的影响。（3）在J774A.1细胞中,用LPS/FLA-ST Ultrapure激活NLRC4炎症小体和LPS/poly（d A:d T）激活AIM2炎症小体,ELISA试剂盒检测DHT、ICT和TNA处理后细胞上清液中IL-1β分泌的影响,验证丹参酮化合物是否抑制NLRC4或AIM2炎症小体的活化。第二部分:（1）DHE或DCFH-DA探针染色处理后的J774A.1细胞,Muse分析仪或荧光酶标仪检测细胞内ROS含量。（2）Mito SOX探针染色处理后的J774A.1细胞,流式细胞仪或荧光酶标仪检测线粒体ROS生成。（3）Mito Q或DPI处理J774A.1细胞,荧光酶标仪检测细胞内ROS或线粒体ROS生成以及ELISA试剂盒检测IL-1β分泌水平,探讨调控NLRP3炎症小体活化ROS来源。第三部分:（1）JC-1荧光探针染色处理后的J774A.1细胞,流式细胞仪或荧光酶标仪检测细胞膜电位的改变。（2）Mito Tracker Green,Mito Tracker Red染色处理后的J774A.1细胞,荧光酶标仪检测细胞荧光强度。（3）细胞线粒体复合物I-III试剂盒检测处理后J774A.1细胞线粒体复合物I-III活性。ATP和NAD+/NADH试剂盒检测处理后J774A.1细胞内ATP和NAD+水平。第四部分:（1）蛋白免疫印迹实验检测处理后J774A.1细胞以及细胞内线粒体的LC3B蛋白表达水平。（2）3-MA或CQ处理J774A.1细胞,ELISA试剂盒检测IL-1β分泌水平,蛋白免疫印迹检测Casepase-1蛋白表达。（3）蛋白免疫印迹实验检测处理后J774A.1细胞AMPK、ACC1蛋白磷酸化表达。第五部分:（1）LPS诱导的败血症小鼠动物模型,灌胃给药DHT,ELISA试剂盒检测小鼠血清和腹腔灌洗液细胞因子;蛋白免疫印迹检测肝脏组织中caspase-1蛋白活性、AMPK磷酸化以及LC3B蛋白表达水平;组织病理学分析小鼠肝脏组织,炎症细胞变化;观察败血症小鼠生存率。（2）MSU诱导的痛风性关节炎大鼠模型,灌胃给药DHT,ELISA实验检测血清IL-1β以及滑膜组织的caspase-1活性;组织病理学分析关节组织,观察病理特征。结果:第一部分:在J774A.1细胞中,15个丹参酮类化合物能够明显的抑制IL-1β的释;CCK-8结果表明丹参酮系列化合物毒性有较大区别。（1）CCK-8结果显示,DHT、ICT和TNA三个代表化合物在0.625～10μM浓度范围内处理J774A.1细胞2 h和24 h与正常对照组（Control组）比较无明显细胞毒性。（2）在巨噬细胞中,ELISA检测结果表明DHT、ICT和TNA三个化合物均能剂量依赖地抑制IL-1β的释放;蛋白免疫印迹实验结果进一步显示在蛋白水平上DHT、ICT和TNA能剂量依赖地抑制caspase-1与IL-1β的表达,但不影响NLRP3、ASC、Pro-IL-1β、Pro-caspase-1蛋白的表达;LDH实验结果显示,DHT、ICT和TNA能剂量依赖地抑制LDH释放;（3）ELISA结果显示DHT、ICT和TNA能够抑制NLRC4炎症小体的激活,但是不抑制AIM2炎症小体的激活。第二部分:（1）DHE或DCFH-DA探针染色荧光结果显示,DHT、ICT和TNA显著地抑制LPS/Nigericin诱导J774A.1细胞ROS的产生。（2）Mito SOX探针染色荧光结果显示,DHT、ICT和TNA抑制LPS/Nigericin诱导J774A.1细胞mt ROS的产生。（3）Mito Q或DPI处理J774A.1细胞,荧光和ELISA结果表明,线粒体来源的ROS的减少可能是丹参酮抑制NLRP3炎症小体激活的原因。第三部分:（1）流式细胞仪或荧光酶标仪检测结果显示,DHT、ICT和TNA能够提高细胞线粒体膜电位。（2）Mito Tracker Green探针染色结果显示,DHT、ICT和TNA对LPS/Nigericin诱导J774A.1细胞荧光无影响;Mito Tracker Red探针染色结果显示,DHT、ICT和TNA能够增强细胞荧光强度。（3）DHT、ICT和TNA提高LPS/Nigericin诱导J774A.1细胞线粒体复合物I-III活性。（4）DHT、ICT和TNA增加LPS/Nigericin诱导J774A.1细胞内ATP和NAD+水平。第四部分:（1）蛋白免疫印迹结果显示,DHT、ICT和TNA能够增加LC3B蛋白的表达,使LC3-I向LC3-II转化。（2）ELISA结果显示,3-MA或CQ处理J774A.1细胞,能够逆转DHT、ICT和TNA抑制IL-1β分泌水平;Western blot结果显示,DHT、ICT和TNA抑制caspase-1的表达被3-MA阻断。（3）蛋白免疫印迹结果显示,DHT、ICT和TNA能够增加处理后J774A.1细胞AMPK、ACC1蛋白磷酸化表达。第五部分:（1）LPS诱导的败血症结果显示,DHT显著减轻败血症小鼠血清和腹腔液中IL-1β、IL-6和TNF-α的产生;肝脏组织蛋白免疫印迹结果显示,DHT抑制败血症小鼠肝脏中caspase-1活性,增强LC3B和AMPK的表达;组织病理学分析小鼠肝脏组织,DHT能够降低炎症细胞浸润;DHT提高败血症小鼠生存率。（2）MSU诱导的痛风性炎症结果显示,DHT能抑制痛风小鼠血清中升高的IL-1β和关节组织内caspase-1活性;关节滑膜组织病理学分析结果显示,DHT能减轻痛风小鼠关节炎症细胞浸润和滑膜增厚粘连现象。结论:本研究中,我们发现收集的15个丹参酮类化合物均能够有效抑制NLRP3炎症小体的激活,不同结构的丹参酮抑制NLRP3炎症小体的作用效果不同。进一步研究表明,DHT、ICT和TNA能够减少LPS/Nigericin诱导巨噬细胞mt ROS的产生以及提高线粒体膜电位、增强线粒体复合物活性以及上调细胞内ATP和NAD+水平。丹参酮抑制线粒体损伤可能是通过促进细胞自噬和AMPK信号激活。更重要的是,我们的研究表明DHT能够改善LPS诱导的败血症小鼠生存率以及LPS诱导的败血症小鼠和MSU诱导的痛风大鼠的炎症反应。本研究为丹参酮化合物治疗NLRP3驱动的炎症性疾病提供了一个潜在的药理学机制,如败血症和痛风炎症。