【摘 要】
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生物活性肽具有多种生理功能,如免疫调控、抗菌、降血压、抗癌等。动物副产物是活性肽的重要来源。鲟鱼软骨作为产量较大的一类加工副产物,富含蛋白质及硫酸软骨素等潜在生物活性物质。本文采用热压、双酶分步酶解结合醇提等手段制备了醇溶性鲟鱼软骨水解产物（ESCH）,对其进行分离纯化、肽序列鉴定及活性探究,并利用脂多糖诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症模型对其抗炎活性进行评价,在转录及翻译水平上探究其可能的抗炎
【基金项目】
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财政部和农业农村部:国家现代农业产业技术体系（CARS-46）；
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生物活性肽具有多种生理功能,如免疫调控、抗菌、降血压、抗癌等。动物副产物是活性肽的重要来源。鲟鱼软骨作为产量较大的一类加工副产物,富含蛋白质及硫酸软骨素等潜在生物活性物质。本文采用热压、双酶分步酶解结合醇提等手段制备了醇溶性鲟鱼软骨水解产物（ESCH）,对其进行分离纯化、肽序列鉴定及活性探究,并利用脂多糖诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症模型对其抗炎活性进行评价,在转录及翻译水平上探究其可能的抗炎机制。主要研究内容和结果如下:（1）采用琼脂糖凝胶电泳、紫外光谱、傅立叶红外光谱、圆二色谱等手段对ESCH的特征物质进行分析,并以一氧化氮（NO）释放量为指标评价其潜在的体外抗炎活性。结果表明:ESCH中未检测到硫酸软骨素,肽分子量主要分布在1 k Da以下（94.71%）。通过氨基酸分析发现,ESCH中存在大量疏水性氨基酸,可能是细胞外基质蛋白的混合水解产物。12.5-800μg/m L的ESCH均为无毒剂量。除800μg/m L外,其余剂量均能极显著降低（P<0.001）巨噬细胞中的NO释放量。（2）采用Sephadex G-15凝胶层析对ESCH进行分离,以巨噬细胞NO释放量及自由基清除活性对分离组分的抗炎、抗氧化活性进行评价,并探究其可能的抗炎机制。结果发现:分离得到的三个粗组分对细胞内NO释放量抑制率分别为F1:5.95-6.37%,F2:6.27-9.38%,F3:14.39-22.17%。选择F3进一步研究:F3明显抑制细胞分泌白介素-6（IL-6）和转化生长因子-β（TGF-β）,增加白介素-10（IL-10）的分泌量。经F3处理后,MAPKs蛋白的磷酸化程度降低,推测F3对炎症的抑制可能与MAPK信号通路介导的细胞因子及炎性介质的释放有关。此外,F3还显示出良好的抗氧化活性,对DPPH和ABTS自由基的清除率分别为28.71%、99.75%。（3）利用疏水层析（ODS）对F3进一步纯化,得到四个组分,采用LC-MS/MS对NO抑制率最高的组分ODS-3进行多肽序列鉴定。在NCBI数据库中进行筛选比对,对肽序列进行合成及活性探究。结果表明:最终筛选得到五条抗炎活性肽,分别是LTGP（Leu-Thr-Gly-Pro,LP4）、LLLE（Leu-Leu-Leu-Glu,LE4）、LLEL（Leu-Leu-Glu-Leu,LL4）、VGPAGPAGP（Val-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro,VP9）和FSGLDGAKGD（Phe-Ser-Gly-Leu-Asp-Gly-Ala-Lys-Gly-Asp,FD10）。除LP4外,其他肽段均未见报道。五条多肽在无细胞毒害作用的剂量范围内均能显著抑制细胞在炎症条件下的NO释放。肽LP4、LE4、LL4、VP9能使细胞的IL-6释放量显著降低,并提高IL-10的分泌水平。LL4对RAW264.7巨噬细胞的转录组研究结果表明,LL4降低体外炎症水平,调节炎症及炎症相关疾病信号通路,可能与Cda、Ccl6、Stfa3、Mrc1及S100a8、Mmp3等基因的下调有关,至少部分源于MAPK和i NOS信号通路的抑制。
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