肿瘤是一项严重威胁人类生命健康的重大疾病,经过多年的研究与发展,抗肿瘤药物的研发取得了诸多的重要成果。药食用真菌资源丰富,次生代谢产物具有可再生性,其类型多样,现代药学研究证实部分药食用真菌具有较好的抗肿瘤、免疫调节、抗氧化等活性。在前期筛选过程中,发现糙皮侧耳、真姬菇、花脸香蘑固体发酵粗提物具有较好的抗肿瘤、抗氧化活性。目前药食用真菌研究多局限于子实体、种植、发酵工艺、多糖、营养价值评价等层面,对其固体发酵产物研究报道较少。高速逆流色谱(HSCCC)是一种新型液-液分配色谱分离技术,选择合适的溶剂体系是HSCCC成功分离的重要步骤。高速逆流色谱与真菌固体发酵技术结合分离活性成分,探索建立快速高效的工业化生产方法,为其提供可靠科学的研究途径与方案。本论文分为三章,分别介绍糙皮侧耳、真姬菇、花脸菇次生代谢产物的化学成分研究及抗肿瘤活性,并建立了对活性成分进行高效快速的高速逆流色谱法分离方法。1通过多种现代色谱和生物技术对糙皮侧耳、真姬菇、花脸香蘑进行了系统的化学成分及生物活性研究,并利用MS、NMR、IR、UV等现代波谱技术鉴定出化合物55个,其中新化合物1个,首次分离的化合物50个;GC-MS鉴定出挥发性成分39个。从中筛选出了萘-γ-吡喃酮asperpyrone F、酚类hydroxytyrosol、苯甲醛类化合物分别对HepG2、A549、SW480具有较强的活性;酚类hydroxytyrosol、苯甲醛类化合物具有优于阳性药物维生素C的抗氧化活性。本章节研究丰富了侧耳属、玉蕈属、香蘑属真菌次生代谢产物化学成分研究,为其深入抗肿瘤、抗氧化等药理学研究和开发利用提供了理论与物质的基础;表明药食两用真菌在固体培养条件下可以产生结构新颖、活性多样的次生代谢产物,是值得深入发掘的重要活性天然产物来源。1.1从糙皮侧耳固体发酵物共分离鉴定出24个化合物,主要化合物类型为二聚萘-γ-吡喃酮类、甾体类、脂肪酸类,分别为:asperpyrone F(1);aurasperone A(2);fonsecinones B(3);aurasperone E(4);fonsecinones A(5);asperpyrones C(6);asperpyrones B(7);flavasperone(8);5,8-Dihydroxy-10-methoxy-2-methyl-4H-naphth-o[1,2-b]pyran-4-onen(9);pyrophen(10);Isopyrophen(11);7-hydroxy-4-methoxy-5-methylcoumarin(12);5-Hydroxymethyl furaldehyde(13);hydroxytyrosol(14);p-Hydroxy-benzeneethanol(15);2-ethyl-1,4-Benzenediol(16);stearic acid(17);oleinic acid(18);glyceryl monooleate(19);9,12-octadecadienoic acid-2,3-dihydroxypropyl ester(20);ergosterol(21);brassicasterol(22);campesterol(23);3β-hydroxy-5α,8α-epidioxyergo-sta-6,22-diene(24)。化合物1为新化合物,化合物2-11、化合物13-19、化合物21、23首次从侧耳属真菌次生代谢产物中分离得到。GC-MS分析得到26种易挥发性成分,主要包括酸、醛、呋喃、酯类化合物。选择化合物1-7,14-16用A549、MG63、SW480、Hep G2进行细胞毒活性筛选,结果显示在浓度10μg/m L时,化合物1-7对Hep G2具有较好的细胞毒活性,1的抑制率达59.3%;14-16对A549具有较好的细胞毒性,14的抑制率达64.9%。DPPH自由基清除活性评价实验,结果显示在浓度10μg/m L时,化合物1-7,14-16均具有较好的抗氧化活性,15对DPPH自由基清除率水平与阳性对照组维生素C相当。1.2从真姬菇固体发酵物中共分离鉴定出29个化合物,主要化合物类型为苯甲醛类、蒽醌类、甾体类、脂肪酸类,分别为:echinuline(1);citreorosein(2);1,8-dihydroxyanthraquinone(3);1-dihydroxyanthraquinone(4);anthrarufin(6CI)(5);alizarina(6);alatinone(7);rheochrysidin(8);5-hydroxy-2-methylanthraquinone(9);4,6-dimethoxyphthalide(10);4,7-dimethoxyphthalide(11);2-(3,8-epoxy-7,9,11-heptadienyl)-6-hydroxy-5-methyl-16-butenyl)benzaldehyde(12);2-(3,8-epoxy-7,9-hep-tadienyl)-6-hydroxy-5-(17-methyl-16-butenyl)benz aldehyde(13);dihydroauroglaucin(14);2-(E-3-heptneyl)-3,6-dihydroxy-(3-methyl-2-butenyl)benzaldehyde(15);isotetrahydroauroglaucin(16);iso-dihydroauroglauci(17);flavoglaucin(18),chaetopyranin(19);6’-Oxo-chaetopyranin(20);javanicin(21);(2α)-A’-Neogammacerane-2,22-diol(22);β-sitosterol(23);stigmasterol(24);ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-one 24-ethyl homolog(25);episterin(26);octadecanoic acid(27);oleinic acid(28);glyceryl monooleate(29)。化合物1-29均为首次从玉蕈属真菌次生代谢产物中分离得到。GC-MS分析得到化合物13个,主要为脂肪酸类化合物。选择化合物12-20用A549、MG63、SW480、Hep G2进行细胞毒活性筛选,结果显示苯甲醛类化合物对SW480的细胞毒活性较强,其中19的IC50为13μg/m L。DPPH自由基清除活性评价实验显示化合物12-20具有较好的抗氧化活性,其中化合物13-15、化合物17的IC50分别为12.5、10.6、3.7μg/m L,优于阳性对照药物维生素C。1.3从花脸香蘑固体发酵物中首次分离得到1个化合物1-hydroxy-6-methyl-9,10-anthraquinone,该化合物对四种不同的人肿瘤细胞A549、Hep G2、MG63、SW480均有一定的细胞毒活性,对A549的IC50为48.2μg/m L,细胞毒活性相对较强。2利用不同的方法选择合适的溶剂体系,通过HSCCC对糙皮侧耳、真姬菇、花脸香蘑大米固体发酵乙酸乙酯粗提物活性成分进行分离纯化,其中合适的溶剂体系是HSCCC成功分离的关键。根据平均极性p?和粗样品的K值选择溶剂体系,是利用溶剂系统与目标化合物“相似相溶”的原理。第一、二章第5节运用该原理选择了相应的溶剂体系,通过HSCCC对糙皮侧耳、真姬菇固体发酵所产生的活性成分进行了快速高效地分离,得到萘-γ-吡喃酮5个、苯甲醛类衍生物6个。结果表明利用平均极性p?和粗样品的K值选择溶剂体系是可行的,为HSCCC溶剂体系选择提供了新的思路,丰富了HSCCC选择溶剂体系的方法,扩大了紫外吸收法选择溶剂体系的范围,可适用于多个类似的化合物或同分异构体的分离。薄层色谱估算法是通过薄层色谱分析目标化合物Rf值与其在相应溶剂体系中的分配系数K值之间的联系,利用HEMWat溶剂体系和SSE展开剂系统的等效对应表进行快速且实用的溶剂选择方法。第三章运用该方法选择了相应的溶剂体系,通过HSCCC从花脸香蘑粗提物中一步分离得到蒽醌类化合物1个。以上实验结果,表明HSCCC是分离二聚萘-γ-吡喃酮、苯甲醛类衍生物、蒽醌类化合物的强大技术,为快速高效地分离真菌抗肿瘤活性成分提供了科学、方便、高效的方法,为抗肿瘤、抗氧化等药理研究及工业化生产提供了科学的途径方案。2.1根据文献调研,探讨了以溶剂体系平均极性p?与粗样品K值为指导标准,选择合适的溶剂体系,分离已知的化合物。在该方法指导下,从多种溶剂体系中选择了溶剂体系石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(5:5:5:5,v/v),溶剂体系平均极性p?=4.92接近已报道的二聚萘-γ-吡喃酮化合物的溶剂体系平均极性p?=5.04,且粗样品K=0.63处于“最佳点”范围内。通过HSCCC从糙皮侧耳粗提物中快速高效地分离到了(fonsecinone B和asperpyrone F)、(asperpyrone C,fonsecinone A和aurasperone A)两组二聚萘-γ-吡喃酮同分异构体,纯度分别为89.0、94.1、95.9、90.9、96.2%,回收率分别为91.3、93.5、90.7、93.4、95.8%,建立起了对糙皮侧耳活性化合物快速高效的分离方法。结果表明,当溶剂体系平均极性接近已报道的类似化合物溶剂系统平均极性时,且粗样品K值处于“最佳点”。参考类似化合物的溶剂体系平均极性p?缩小溶剂体系选择范围,并结合粗样品K值从多个溶剂体系中选择最佳体系的方法是可行的。2.2根据文献调研,探讨了溶剂体系平均极性p?与粗样品K值的关系,并选择合适的溶剂体系,分离未知化合物。在该方法指导下,固定三项溶剂体积比,从多种溶剂体系中选择了溶剂体系油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(8:3:8:1,v/v),溶剂体系平均极性p?与真姬菇粗样品K值具有线性关系,方程式:Y=19.333X2-118.44X+182.14,R2=0.997(Y代表K值,X代表平均极性p?)。通过HSCCC从真姬菇粗提物中分离纯化到两组类似的苯甲醛衍生物,分别为iso-dihydroauroglaucin,isoaspergin,isotetrahydro-auroglaucin,flavoglaucin;6’-Oxo-chaetopyranin和chaetopyranin,纯度分别为93.8、95.6、97.4、95.0、90.7、90.1%,回收率分别为95.4、94.2、95.7、93.4、95.8、92.8%,建立起了真姬菇活性化合物快速高效的分离方法。结果表明,在溶剂体积发生规律性改变时,溶剂体系平均极性p?与粗样品的K值间存在线性关系,利用该方法选择溶剂体系是可行的。该方法扩大了平均极性p?与粗样品K值在溶剂体系选择中的应用范围,相对于参考已知文献并计算平均极性p?和K值的方法更简单、快速,可用于成分未知的样品分离。2.3薄层色谱估算法是利用HEMWat溶剂体系和SSE展开剂系统的等效对应表进行快速且实用的溶剂选择方法,研究表明薄层硅胶板上目标化合物Rf值在0.29和0.71之间(最佳值为0.5)将具有0.4至2.5之间的K值(最佳值为1)。该方法简单快捷,但国内报道较少。在该方法指导下,选择了溶剂体系石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(9:1:9:1,v/v),并石油醚替代正己烷,取上层溶剂展开目标化合物,其Rf值接近0.5。通过HSCCC从花脸香蘑乙酸乙酯提取物中一步分离得到目标化合物1-hydroxy-6-methyl-9,10-anthraquinone,纯度为95.6%,回收率为97%,建立起了花脸香蘑活性成分快速高效的分离方法。结果表明薄层色谱估算法用于选择溶剂体系是可行的,丰富了HSCCC溶剂系统的选择方法。