研究背景和目的:骨髓炎是骨科的常见病和多发病,是骨组织受到细菌引起的骨髓腔、骨和骨膜及周围组织的急性或慢性炎症过程。金黄色葡萄球菌是骨髓炎主要的致病菌,占所有骨髓炎病例的80%。金黄色葡萄球菌的致病性是一个复杂的过程,其致病性的强弱取决于所产生的毒素和酶。杀白细胞素(PVL)是金黄色葡萄球菌分泌的一种特有的外毒素,属于双组份毒素家族的成员,由LukS-PV和LukF-PV组成。PVL通过在细胞膜上形成穿膜孔杀伤白细胞。很多研究显示PVL在金黄色葡萄球菌所致的坏死性皮肤损害和坏死性肺炎等疾病起重要作用。葡萄球菌A蛋白(SpA)是葡萄球菌细胞壁的一种表面蛋白,可与多种哺乳动物IgG的Fc结合,具有抗吞噬,促细胞分裂,引起超敏反应、损伤血小板等多种生物学活性。凝固酶(Coa)是金黄色葡萄球菌的重要致病因子,具有保护病原菌不被宿主细胞吞噬和避免抗体结合的作用。虽然PVL,SpA和Coa已经被证实是金黄色葡萄球菌的重要致病因子,但是三者在金黄色葡萄球菌引起骨感染导致骨髓炎的作用仍不清楚。因此,本课题通过构建金黄色葡萄球菌毒力因子PVL,SpA和Coa的过表达质粒和基因删除质粒,运用各种检测手段和方法观察这三者对成骨细胞增殖和凋亡,骨代谢和分化以及核因子-κB受体活化因子配体(RANK-L)的影响,探讨金黄色葡萄球菌毒力因子PVL,SpA和Coa在骨髓炎中的作用及可能的调控机制。研究方法:1)采用RT-PCR技术和酶切-连接克隆方法构建PVL、SpA和Coa表达质粒,利用同源重组构建PVL、SpA和Coa基因删除质粒,并利用电转将基因删除质粒转入金黄色葡萄球菌,通过温度和红霉素抗性压力筛选金黄色葡萄球菌PVL,SpA和Coa基因缺失突变株;2)运用MTT法和Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术观察PVL,SpA和Coa对成骨细胞增殖和凋亡的影响,并利用western blot观察金黄色葡萄球菌毒力因子PVL,SpA和Coa对成骨细胞中caspase-3和caspase-9活性的影响;3)利用分别转染PVL,SpA和Coa表达质粒或基因删除质粒的金黄色葡萄球菌感染MC3T3-E1细胞,运用RT-PCR方法观察PVL,SpA和Coa对I型胶原(collagen I)、骨桥蛋白(OPN)和骨钙素(OC)mRNA表达水平的影响;4)转染PVL、SpA和Coa表达质粒或基因删除质粒的金黄色葡萄球菌感染mc3t3-e1细胞后,利用茜素红法和vonkossa法观察骨细胞的矿化结节情况,并利用碱性磷酸酶(alp)活性检测试剂盒观察alp的活性;5)利用分别转染pvl、spa和coa表达质粒或基因删除质粒不同质粒的金黄色葡萄球菌感染mc3t3-e1细胞,运用elisa方法观察pvl,spa和coa对细胞中rank-l表达的影响。研究结果:1)采用dna重组技术和同源重组,成功构建金黄色葡萄球菌毒力因子pvl、spa和coa表达质粒pmd19-t-pvl、pmd19-t-spa和pmd19-t-coa以及基因删除质粒pmad△pvl、pmad△spa和pmad△coa,并成功获得金黄色葡萄球菌pvl,spa和coa基因缺失突变株pvl(-),spa(-)和coa(-);2)感染24h后,经转染了pvl,spa和coa表达质粒的金黄色葡萄球菌感染的mc3t3-e1细胞增殖抑制率分别为29.2%,42.8%和32.7%,与单纯金黄色葡萄球菌感染组别(28.2%)相比均有升高;经转染了pvl,spa和coa基因删除质粒的金黄色葡萄球菌感染的细胞增殖抑制率分别为12.3%,12.1%和17.2%,与单纯金黄色葡萄球菌感染组别相比均有下降。随着作用时间越长,转染毒力因子表达质粒的金黄色葡萄球菌感染组别其抑制效果显著地升高,而转染毒力因子基因删除质粒的金黄色葡萄球菌感染组别其抑制效果显著地减弱;与单纯金黄色葡萄球菌感染组相比,含有pvl,spa和coa表达质粒金黄色葡萄球菌感染组的mc3t3-e1细胞凋亡率明显提高;而含有pvl,spa和coa基因删除质粒金黄色葡萄球菌感染组的mc3t3-e1细胞凋亡率略有下降;pvl,spa和coa表达质粒金黄色葡萄球菌感染组细胞的pro-caspase-3表达量比单纯金黄色葡萄球菌感染组明显下降(p<0.05),cleaved-caspase-3表达量显著升高;而转染pvl,spa和coa基因删除质粒金黄色葡萄球菌感染组细胞的pro-caspase-3表达量比单纯金黄色葡萄球菌感染组略有升高(p<0.05),cleaved-caspase-3表达量略有下降,但是两者之间无统计学意义。pro-caspase-9和cleaved-caspase-9的表达水平与pro-caspase-3和cleaved-caspase-9表达水平趋势一致;3)金黄色葡萄球菌毒力因子pvl,spa和coa抑制collageni、opn和ocnmrna水平的表达;4)与未感染组相比,含有pvl,spa和coa表达质粒金黄色葡萄球菌感染组细胞的钙沉淀显著地降低(p<0.05),alp活性也显著地降低(p<0.05)。与金黄色葡萄球菌感染组相比,含有pvl,spa和coa表达质粒金黄色葡萄球菌感染组细胞的钙沉淀显著地降低,alp活性也明显地降低(p<0.05);5)未感染组细胞中rank-l的表达非常低。与未感染组相比,金黄色葡萄球菌感染组,含有pvl,spa和coa表达质粒或基因删除质粒金黄色葡萄球菌感染组mc3t3-e1细胞的rank-l表达显著地升高,具有统计意义(P<0.05)。与培养基感染组相比,金黄色葡萄球菌感染组细胞的RANK-L表达明显地增加(P<0.05)。研究结论:1)金黄色葡萄球菌毒力因子PVL,SpA和Coa以时间依赖方式抑制MC3T3-E1细胞增殖,同时促进MC3T3-E1细胞发生凋亡,PVL,SpA和Coa可能通过线粒体途径诱导MC3T3-E1细胞发生凋亡;2)金黄色葡萄球菌毒力因子PVL,SpA和Coa抑制collagen I、OPN和OCN mRNA水平的表达,影响了成骨细胞的正常代谢;3)金黄色葡萄球菌毒力因子PVL,SpA和Coa抑制成骨细胞的矿化和ALP的活性,影响成骨细胞的分化;4)金黄色葡萄球菌毒力因子PVL,SpA和Coa促进成骨细胞中RANK-L的表达。由此推测PVL,SpA和Coa可能通过影响成骨细胞骨形成和破骨细胞骨吸收过程,打破骨代谢的平衡,导致骨质疏松,加重骨髓炎的程度。