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苹果是世界上重要的经济果树,我国是最大的苹果种植国家,面积和产量均居世界首位。苹果花叶病是苹果生产中最常见的病毒性病害,发生普遍而严重。病原的准确鉴定是病害防控的前提,而我国苹果花叶病的病原一直没有明确的定论。近期从苹果坏死花叶样品中分离出的新病毒—苹果坏死花叶病毒(Apple necrotic mosaic virus,ApNMV)可能与我国苹果花叶病症状相关。为此,研究调查了 ApNMV在我国的发生分布,分析了与花叶症状的相关性,并对ApNMV的基因组结构、分类地位、检测方法和致病性进行了研究。主要内容如下:检测了我国陕西、山东等苹果产区291份苹果花叶病样品带毒情况,花叶样品中ApNMV的检出率高达92.1%,未检测到ApMV和PNRSV的发生;同时,分析了前人普遍用于我国花叶病样品中ApMV、PNRSV调查的引物的特异性。结果表明了 ApMV、PNRSV检测引物不具有特异性,说明ApMV和PNRSV可能不是引起我国苹果花叶病的病原,而ApNMV与花叶病症状的高度相关性,说明ApNMV可能是我国苹果花叶病的重要病原。克隆了 6条ApNMV中国分离物全基因组序列,基因组大小分别为3378-3380 nt(RNA1),2778-2786 nt(RNA2)和1909-1955 nt(RNA3),与日本分离物P129基因组序列一致性分别为95.4-96.5%,88.5-94.5%,86.2-91.1%。RNA1、RNA2 的 5,UTR 的核酸序列一致性分别为 95.1%和84.8%,RNA3的5’UTR核酸序列一致性仅为74.1%,序列变异较大。靠近3’末端的3’UTR的125 nt序列一致性为91.9-99.2%,包括一个预测的茎环结构,在茎部位置有两个AUGC motif,序列高度保守。6个全基因组中,MP和CP之间的非编码间隔区(intergenicregion,IR)长度为98-103nt,与P129的IR(145nt)存在较大差异。系统发育分析结果表明,ApNMV在分类上属于雀麦花叶病毒科等轴不稳环斑病毒属第3亚组,与ApMV和PNRSV具有同源性。ApNMV RNAs 1-3与ApMV和PNRSV的核酸序列一致性分别为49.2-59.8%和57.4-64.3%,核酸序列一致性较低。通过比较ApNMV和GenBank中已登录的所有的ApMV、PNRSV的MP和CP核酸序列,进一步说明ApNMV与ApMV和PNRSV存在进化上的差异性。构建了 ApNMV CP蛋白原核表达重组质粒,诱导表达并纯化出目的蛋白2.4 mg,制备出ApNMV的多克隆抗体,首次建立了成本低、效率高、适用于大样本的ApNMVELISA检测体系。另外,体外转录出ApNMVCP的RNA产物,制作了 RT-qPCR的标准曲线,建立了一种操作简单、重复性好、特异性强、灵敏度高的ApNMV一步RT-qPCR探针检测方法,实现对苹果样品中ApNMV的高效、快速诊断。构建了 ApNMV全长侵染性cDNA克隆,农杆菌注射接种和摩擦接种本生烟验证了其生物活性,但不引起明显症状。接种四叶黄瓜子叶12天后,植株即表现明显的花叶症状,叶片初始表现黄色斑点,逐渐形成黄色褪绿区,后表现皱缩。相比之下,ApMV在接种后8天,黄瓜叶片出现花叶、褪绿、轻微卷曲,之后叶片严重黄化、褪绿和卷曲,植株矮化、停止生长,甚至死亡。综上所述,本研究明确了 ApNMV与我国苹果花叶病症状高度相关,获得了 6条ApNMV全基因组序列,鉴定了其分类地位,建立了常规检测体系,并验证了 ApNMV侵染性克隆的致病性,为其流行发生规律、致病机理和抗病基因工程研究奠定基础,为苹果ApNMV抗性或耐性种质资源筛选提供便利手段,以及有助于我国苹果产业中花叶病的科学防控。