丝素蛋白是从蚕丝中提取的天然高分子纤维蛋白,具有良好的理化特性及生物相容性。再生丝素蛋白是由丝素蛋白经物理方式、环氧剂或SD交联而成的新型医用生物材料。近年来,研究者通过物理或化学方法将丝素蛋白制备了符合临床实际需要的再生多孔丝素膜,用于创面的修复。该材料具有良好的机械强度,不溶于水,膜的多孔结构使其富有较好通气性的同时,可阻挡病原微生物侵入创面。该材料经机体吸收后可在体内逐渐被降解代谢。本研究在已对家蚕丝素蛋白对B细胞应答影响的研究基础上,又深入探讨了不同性状的再生家蚕丝素蛋白在小动物体内及体表应用后对T细胞应答的影响,从而为丝素蛋白类材料临床应用后的免疫原性研究提供实验依据。目的:通过研究不同性状再生家蚕丝素蛋白材料对T细胞活化、增殖及分化的影响,分析丝素蛋白类材料的免疫原性。方法:1.液状再生家蚕丝素蛋白体内运用对小鼠T细胞的激发作用将ICR小鼠随机分组,每组6只,实验组经腹腔注射1%的液状再生家蚕丝素蛋白0.5ml/只,以注射等量的无菌PBS为对照组。分别于第7d及第14d无菌取脾脏。制备细胞悬液作以下分析:1.1小鼠脾脏细胞中CD3~+CD25~+、CD4~+CD25~+及CD4~+CD25~+ Foxp3~+T细胞的分析将上述分离的脾脏细胞置于流式分析管中(3×105细胞/管)。分别加入下列抗鼠直标抗体:第一组:CD3-FITC、CD25-APC;第二组:CD4-FITC、CD25-APC;第三组:CD4-FITC、CD25-APC及Foxp3-PE,反应后经FCM分析。1.2经再生家蚕丝素蛋白处理的小鼠脾脏细胞对ConA的反应性将上述分离的小鼠脾脏细胞加入96孔培养板,2×105/100μL/孔,加入ConA,终浓度分别为0μg/ml、2.5μg/ml及5μg/ml。培养至72h,MTT检测细胞的增殖情况。同时采用FCM分析CD4~+CD25~+及CD4~+CD25~+Foxp3~+T的表达。2、膜状再生家蚕丝素蛋白在大鼠创面运用后对T细胞的激活作用2.1外科创伤面的建立将SD大鼠麻醉后经外科手术切除背部皮肤建立创面,面积为2 cm×2 cm。覆盖经预处理的膜状再生多孔丝素,将已切除皮肤的表皮盖在丝素膜上,进行缝合。以PVA海绵设为阳性对照,假手术组为阴性对照。2.2移植处皮肤的病理学变化分别于术后第3d、14d、28d、56d及90d,在麻醉状态下取移植处皮肤,制作石蜡切片后行HE染色,分析炎性细胞的浸润及创面愈合情况。2.3外周血、脾脏及胸腺中T细胞活化的动态变化于上述各时间点,取抗凝血分离PBMC,将大鼠处死,分离脾脏及胸腺细胞经FCM检测CD3~+CD25~+T的比率。同时行免疫组化分析。结果:1.1液状再生家蚕丝素蛋白体内运用后对小鼠T细胞活化与分化的影响FCM分析的结果显示,腹腔注射液状再生丝素蛋白后第7d及第14d,脾脏细胞中CD3~+CD25~+T细胞的百分率分别为(7.32±1.02)%及(7.58±0.98)%;与对照组((7.262±1.31)%及(6.98±1.22)%)比较稍有升高,但无显著性差异(P﹥0.05)。CD4~+CD25~+T细胞的百分率分别为(7.22±0.92)%及(7.38±0.49)%;与对照组((7.19±0.58)%及(7.03±0.69)%)比较稍有升高,但无显著性差异(P﹥0.05)。CD4~+CD25~+Foxp3~+T百分率分别为(3.52±0.62)%及(3.78±0.56)%。与对照组((3.47±0.31)%及(3.44±0.65)%)比较稍有升高,但无显著性差异(P﹥0.05)。提示再生丝素蛋白可能对小鼠T细胞无明显的激发作用。2、膜状再生家蚕多孔丝素蛋白对大鼠T细胞的激活作用2.1移植处皮肤的病理学变化膜状再生家蚕丝素蛋白移植后第3d及第14d时,移植处可见少量炎性细胞,28d后炎症细胞已明显减少,第56d时已无炎症细胞。而阳性对照组大鼠术后均有炎症细胞浸润,至56d后才逐渐减少。2.2外周血、脾脏及胸腺细胞中T细胞活化的动态变化于术后第3d、14d、28d、56d及90d各时间点,膜状再生家蚕丝素蛋白移植组大鼠PBMC、脾脏及胸腺中CD3~+CD25~+T细胞百分比率经FCM分析结果如表4所示:三者与阴性对照组比较均无显著性差异(P﹥0.05)。而与阳性对照组比较均有显著性差异(P<0.05)。同时免疫组化的分析结果显示:实验组脾脏及胸腺组织中只有极少量的CD25~+T细胞,与FCM分析的结果一致。提示再生丝素蛋白对T细胞的激发作用较弱。结论:体内外研究显示,再生家蚕丝素蛋白对机体T淋巴细胞的激发作用较小,引发机体细胞免疫应答的能力较弱,是一种低免疫原性的生物材料。