单碱基突变（Single-nucleotide variants,SNV）是生物医学研究和临床应用的重要分子标志物。因此,开发性能优越的SNV检测技术一直是核酸生物技术的重点。沃森-克里克杂交规则是核酸检测技术运作的基本原则。目前,已经有大量基于杂交特异性识别SNV的方法被开发,如基于单杂交探针、分子信标和二元探针等。然而,以上基于杂交的SNV识别方法依然存在以下问题:（1）这些方法大多只能对一整条链进行野生型或者突变型的判定,而难以将突变定位到更小的区域。这使得在精确SNV识别中,通常会在无关区域的检测上花费较高成本和大量时间,从而阻碍SNV识别效率的提高。（2）靶标分子自折叠形成的非预期二级结构会对分子间的杂交造成一个高的热力学能垒,这将减缓DNA杂交的过程,以致在单位时间内识别SNV的结果被影响甚至发生错误。（3）在低丰度的SNV识别中,难以进一步无差别地阻隔大量存在的非靶标,这阻碍了低丰度SNV识别的特异性和选择性提高。为解决这些问题,本文主要研究了以下内容:1.本文提出了一种基于消除靶标的非预期二级结构而实现域级SNV识别的策略。通过杂交手段将靶标DNA组装到刚性双链中。在刚性结构中,自折叠的靶标被拉伸从而达到消除靶标非预期二级结构的目的。由于靶标不同位置的突变会对双链稳定性或者杂交过程中的分支迁移造成影响,因此,通过使用探针问询双链的性质可以实现将突变位点定位到域级水平的目的。最后结果表明,该策略成功消除了靶标的非预期二级结构,并通过探针报道了更丰富的靶标的域级信息,从而提供了一种能在室温下运行的域级SNV识别平台。该策略不仅成功区分了野生型和突变型,还能从三种突变可能性中准确识别出BRAF-V600E所在的突变域。2.一种基于无差别阻隔干扰序列而实现高特异性SNV识别的策略被开发。在可逆反应中,反应的热力学易通过反应物或产物浓度调控。受此启发,基于立足点交换反应的可逆性质,通过向反应中额外加入过量副产物可抑制反应正向进行。在理想情况下,所有干扰序列与探针的非预期杂交反应都能够被进一步抑制,从而实现对所有干扰序列的无差别阻隔。结果表明,与未使用浓度抑制的系统相比较,该策略能够极大地提高SNV识别的特异性。同时,任意位置发生突变的非靶标都能被浓度抑制有效阻隔。基于以上优势,该策略最终识别出了丰度为1%的靶标。3.一种将浓度抑制与熵驱动催化放大相整合以实现高选择性的低丰度SNV识别策略被提出。在浓度抑制中,额外加入产物可抑制可逆反应正向进行,从而阻隔非靶标,以提升SNV识别的特异性。然而,这种改善会牺牲靶标的产率。因此,为了在保证高特异性的基础上提高靶标的产率,浓度抑制和熵驱动催化放大被结合。因为理论上靶标能够与立足点交换探针杂交从而激活后续的熵驱动的催化放大网络,而大量的非靶标能够被过量的浓度抑制所阻隔,难以与探针杂交。结果表明,该策略的SNV识别特异性优于任何单一浓度抑制或者熵驱动的催化放大模块。最终,该策略实现了对0.1%丰度的目标SNV的检测。此外,即使混合物中含有三种1000倍的干扰序列,该策略仍然可以识别出目标SNV。