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猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）、猪圆环病毒Ⅱ型（Porcine circovirus type 2,PCV-2）、猪伪狂犬病病毒（Porcine pseudorabies virus,PRV）是3种重要的猪传染病病原,流行病学调查表明,上述3种病毒广泛存在于猪群当中,且常常混和感染猪群而引起发病。虽然针对每一种病原的诊断方法已然广泛应用,但是常规的病原学、血清学诊断方法由于其费时、费力等劣势已很难满足实际生产的需要,因此,建立一种省时、省力、自动化程度且可以同时检测3种病原的方法就显得尤为重要。实时荧光定量PCR是20世纪90年代发展起来的一种检测核酸分子的新技术,SYBR Green-Ⅰ作为一种非序列特异性的荧光染料被广泛地应用与荧光定量PCR中,其原理是在PCR体系中加入SYBR Green-Ⅰ,通过荧光强度的变化,可以对PCR过程进行实时监测,最后通过标准曲线可以对未知样品中的核酸分子进行准确定量分析,也可以通过溶解曲线对未知样品进行定性分析。基于SYBR Green-Ⅰ的定量PCR方法与其它类型的定量方法相比具有简便易行、成本低廉的优点,目前,该技术已被广泛应用与生命科学研究的各个领域。本研究拟应用SYBR Green-Ⅰ实时荧光PCR技术建立检测PRRSV、PCV-2、PRV的快速诊断方法。本研究首先根据GenBank登录的PRRSV N蛋白基因、PCV-2 rep蛋白基因和PRV gE基因的核酸序列设计三对特异引物,各病毒扩增片段长度为:PRRSV81bp、PCV-2 130bp、PRV 130bp,将这3个基因的部分核酸序列进行克隆并测序,然后将3种病毒的重组质粒测OD260,计算得出其浓度:拷贝/μL,并进行梯度稀释,将其作为标准品分别建立3种病毒SYBR Green-Ⅰ实时荧光定量PCR方法,建立的3种病毒的实时荧光定量PCR方法相关系数（R2）分别为:PRRSV 0.998、PCV-2 0.996、PRV 0.983,扩增效率分别为:PRRSV 1.01、PCV-2 0.92、PRV 0.98。PRRSV特异性试验显示,对照组PCV-2、PRV、PPV、CSFV均无特异性扩增;PCV-2特异性试验显示,对照组PRRSV、PRV、PPV、CSFV均无特异性扩增;PRV特异性试验显示,对照组PRRSV、PCV-2、PPV、CSFV均无特异性扩增。敏感性试验表明,3种病毒定量PCR方法的检测敏感性可达:PRRSV 25拷贝/μL、PCV-2 50拷贝/μL、PRV 50拷贝/μL。3种病毒3个浓度的标准品重复性试验表明,PRRSV（100、50、25拷贝/μL）批内重复性试验变异系数分别为1.15%、2.12%、2.45%,批间重复性试验变异系数分别为2.59%、2.23%、2.63%;PCV-2（1000、100、50拷贝/μL）批内重复性变异系数分别为1.26%、1.07%、1.44%,批间重复性试验变异系数分别为4.44%、2.19%、2.14%;PRV（1000、100、50拷贝/μL）批内重复性变异系数分别为2.64%、2.64%、2.79%,批间重复性试验变异系数分别为4.83%、3.52%、3.94%。实验结果表明,3种病毒的SYBR Green-Ⅰ荧光定量PCR方法具有良好的特异性、敏感性和重复性。在建立了3种病毒荧光定量PCR的基础之上,我们将3种病毒的引物放入同一定量PCR管中,利用3种病毒扩增产物TM值的不同,建立了多重SYBR Green-Ⅰ实时荧光定性PCR方法,对PRRSV、PCV-2、PRV进行定性分析,该方法通过溶解曲线分析,可以同时区分3种病毒,实验中确定3种病毒扩增产物的TM值分别为:PRRSV 82.8-83.8℃、PCV-2 84.96-85.68℃、PRV 92.1-93.28℃。特异性试验表明,PRRSV、PCV-2、PRV有特异性的峰值出现,而PPV、CSFV及阴性对照无特性性的峰值产生;敏感性试验表明,单独检测各病毒时,PRRSV、PCV-2的敏感性可以达到250拷贝/μL,PRV可以达到500拷贝/μL;重复性试验结果表明,3种病毒的TM值批内重复试验的变异系数分别为:PRRSV 0.12%、PCV-2 0%、PRV 0.1%,批间重复性试验的变异系数分别为:PRRSV 0.10%、PCV-2 0.07%、PRV 0.05%。实验结果表明,3种病毒的多重SYBR Green-Ⅰ实时荧光定性PCR方法具有较好的特异性、敏感性和稳定性。本研究成功建立了PRRSV、PCV-2、PRV 3种病毒的SYBR Green-Ⅰ实时荧光定量PCR方法及多重SYBR Green-Ⅰ实时荧光定性PCR方法,可以对这3种病毒进行定量或定性的快速检测,也为检测试剂盒的研制奠定了基础。