论文部分内容阅读
背景：通过化学诱导剂诱导一系列内源性抗氧化酶、抗氧化蛋白、神经保护因子的表达，有可能成为抵抗脑缺血再灌注应激损伤的有效神经保护新策略。天麻的重要酚类成分4-HBA(4-hydroxybenyzlalcohol)可通过抗氧化、抗焦虑，镇静、镇痛等作用发挥对中枢神经系统的保护功能。近年来发现4-HBA可能通过增加一些内源性保护因子的表达，发挥治疗脑卒中的功效，但具体机制尚不清楚。目的：本研究旨在体外原代神经元氧糖剥夺（OGD）模型和体内大鼠大脑中动脉暂时性缺血再灌注(MCAO)模型中，从细胞、动物和分子水平上观察并探讨4-HBA治疗脑缺血再灌注损伤的保护作用及相关信号转导机制。方法：1、采用无血清培养法，培养原代新生SD大鼠皮质神经元5-7天，更换无糖培养液放入三气培养箱中，建立OGD模型。4-HBA(0.05mM,0.1mM,0.5mM)处理后，采用MTT、LDH的方法检测4-HBA对OGD后神经元细胞存活率、细胞活力的影响。2、采用Westernblot和免疫荧光的方法观察4-HBA处理后内源性保护因子Prdx6、PDI及重要转录因子Nrf2的表达、亚细胞定位的改变情况。3、采用Westernblot方法检测4-HBA激活的信号转导通路关键蛋白的表达。进一步予以PI3K/AKT、p38/MAPK、ERK/MAPK、JNK/MAPK信号通路相对应的阻滞剂LY294002、SB203580、PD98059、SP600125进行干预，采用MTT、LDH的方法检测各个信号通路在4-HBA神经保护作用中的影响。4、采用Westernblot和免疫荧光的方法观察PI3K/AKT信号通路在4-HBA抵抗神经元氧化应激损伤以及诱导Prdx6、PDI、Nrf2蛋白表达中的作用。5、建立稳定可靠的大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型(MCAO模型)。用不同浓度4-HBA（25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg），腹腔注射，造模前连续给药2天，最后一次在造模前30min给药（一共给药3次），观察4-HBA对MCAO后大鼠的神经学功能、梗死体积、形态学的影响，并通过脑组织匀浆SOD、MDA的测定评价4-HBA对大鼠脑缺血再灌注氧化应激损伤的神经保护作用。6、在体内实验中进一步确证PI3K/AKT信号通路在4-HBA抵抗脑缺血再灌注损伤以及诱导Prdx6、PDI、Nrf2蛋白表达中的作用。结果：1、4-HBA处理可以增加OGD后神经元的存活率，减少LDH的释放，抵抗氧糖剥夺造成的氧化应激损伤，发挥神经保护作用。其中，0.1mM4-HBA的保护作用最显著。2、4-HBA处理后，可以明显改善脑缺血再灌注损伤后大鼠神经功能缺失，缩小脑缺血再灌注损伤后大鼠脑梗死体积，增加完整神经元细胞数目，减轻缺血病理改变，减轻脑缺血再灌注自由基导致的氧化应激损伤，发挥神经保护作用。其中，50mg/kg4-HBA的保护作用最显著。3、本研究通过体内外模型研究4-HBA的神经保护作用机制及信号转导途径。实验结果显示，4-HBA处理可以增加p-AKT/AKT比值，激活PI3K/AKT通路，促进转录因子Nrf2进入细胞核内，诱导Prdx6、PDI的表达，发挥神经保护功能。当LY294002同时存在时，4-HBA的神经保护功能受到抑制；p-AKT/AKT比值、Prdx6、PDI和Nrf2的表达均低于4-HBA单纯处理组。结论：4-HBA通过激活PI3K/AKT信号转导通路，促进重要转录因子Nrf2蛋白表达并向细胞核内聚集，诱导Prdx6、PDI表达，抵抗脑缺血再灌注应激损伤。