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弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种常见的机会性致病原虫，普遍寄生于人和多种动物的有核细胞内，可引起人兽共患弓形虫病，对孕妇或免疫缺陷患者（如器官移植、艾滋病及恶性肿瘤患者）造成严重的威胁。研制安全、高效、廉价的疫苗被认为是弓形虫防治的重要措施。核酸疫苗作为第三代疫苗，具有制备简单、能诱导体液免疫和细胞免疫应答等优势。基于甲病毒复制子设计的核酸疫苗，包括自主复制型RNA疫苗和自杀性DNA疫苗，利用甲病毒复制子的自主复制功能，在宿主细胞中高水平表达插入的外源抗原基因，而且能够宿主细胞的凋亡，呈现出比常规的核酸疫苗更好的应用前景。弓形虫核苷三磷酸脱氢酶Ⅱ(nucleosidetriphosphate hydrolaseⅡ，NTPase-Ⅱ)是分布于弓形虫速殖子表面的一种主要特异性抗原，对虫体在宿主细胞内的寄生和繁殖都具有重要的作用。本研究构建基于Semliki Forest Virus(SFV)甲病毒复制子的弓形虫NTPase-Ⅱ自主复制型RNA疫苗和自杀性DNA疫苗，评价它们在小鼠体内诱导的体液免疫应答和细胞免疫应答及其抗弓形虫的免疫保护作用，为弓形虫新型核酸疫苗的研制提供新型载体。 目的： 1.制备基于SFV甲病毒复制子的弓形虫NTPase-Ⅱ自主复制型RNA疫苗和自杀性DNA疫苗; 2.评价弓形虫NTPase-Ⅱ自主复制型RNA疫苗和自杀性DNA疫苗诱导的免疫反应和免疫保护性，为弓形虫核酸疫苗的研制提供新型载体。 方法： 1.弓形虫NTPase-Ⅱ自主复制型RNA疫苗和自杀性DNA疫苗的制备 从弓形虫RH株基因组中扩增到NTPase-Ⅱ基因，分别插入到两个基于SFV甲病毒复制子疫苗载体pRREP-eGFP和pDREP-eGFP构建重组质粒pRREP-NTPase-Ⅱ和pDREP-NTPase-Ⅱ。将pRREP-NTPase-Ⅱ质粒体外转录和加帽制备弓形虫NTPase-Ⅱ自主复制型RNA疫苗，大量提取pDREP-NTPase-Ⅱ质粒并纯化制备弓形虫NTPase-Ⅱ自杀性DNA疫苗。 2.弓形虫NTPase-Ⅱ自主复制型RNA疫苗和自杀性DNA疫苗的体外鉴定 采用脂质体转染法，将制备的弓形虫NTPase-Ⅱ自主复制型RNA疫苗和自杀性DNA疫苗分别转染人源胚胎肾细胞293T，经间接免疫荧光技术IFA检测插入的抗原基因NTPase-Ⅱ能否在293T细胞中的表达。 3.弓形虫NTPase-Ⅱ自主复制型RNA疫苗和自杀性DNA疫苗对小鼠的免疫保护作用及其机制研究 将制备的弓形虫NTPase-Ⅱ自主复制型RNA疫苗pRREP-NTPase-Ⅱ和自杀性DNA疫苗pDREP-NTPase-Ⅱ，采用肌肉注射联合瞬时电穿孔的方式分别免疫BALB/c小鼠，以pRREP-eGFP和pDREP-eGFP分别作为各自的疫苗对照，以PBS作为空白对照。ELISA法检测免疫小鼠血清中特异性的总IgG抗体及IgG1和IgG2a抗体亚类，评价诱导的体液免疫反应水平;CCK-8法检测免疫小鼠脾淋巴细胞增殖，ELISA法检测小鼠脾淋巴细胞分泌的4种细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10的含量，流式细胞术检测小鼠脾淋巴细胞中CD4+T细胞和CD8+T细胞的百分数，评价诱导的细胞免疫反应;对免疫小鼠腹腔注射弓形虫强毒株RH株速殖子进行急性攻击感染记录各组小鼠的生存时间，对免疫小鼠灌胃感染弓形虫成囊株Pru株进行慢性感染5周后计算各组小鼠脑组织中的包囊数，来评价疫苗对免疫小鼠抗弓形虫感染的免疫保护作用。 结果： 1.从弓形虫RH株基因组中扩增到NTPase-Ⅱ基因，经测序鉴定成功构建了两个基于SFV甲病毒复制子的弓形虫NTPase-Ⅱ核酸疫苗载体pRREP-NTPase-Ⅱ和pDREP-NTPase-Ⅱ，制备了弓形虫NTPase-Ⅱ自主复制型RNA疫苗和自杀性DNA疫苗; 2.将制备的弓形虫NTPase-Ⅱ自主复制型RNA疫苗pRREP-NTPase-Ⅱ和自杀性DNA疫苗pDREP-NTPase-Ⅱ分别转染293T细胞，用NTPase-Ⅱ单抗经IFA检测NTPase-Ⅱ蛋白的表达。与对照组相比，转染NTPase-Ⅱ核酸疫苗的细胞检测到特异性的绿色荧光，表明制备的弓形虫NTPase-Ⅱ核酸疫苗能够介导外源插入的NTPase-Ⅱ抗原基因在哺乳动物细胞中表达成蛋白; 3.将弓形虫NTPase-Ⅱ自主复制型RNA疫苗pRREP-NTPase-Ⅱ和自杀性DNA疫苗pRREP-NTPase-Ⅱ分别免疫BALB/c小鼠。与对照组相比，ELISA法检测到免疫组小鼠血清中IgG抗体及IgG1和IgG2a显著升高，且IgG2a/IgG1＞1，pDREP-NTPase-Ⅱ比pRREP-NTPase-Ⅱ诱导了更高水平的体液免疫应答;ELISA法检测到免疫组小鼠脾淋巴细胞分泌的IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10细胞因子浓度均显著升高，且IFN-γ浓度高水平升高，IL-4浓度低水平升高;经流式细胞术分析，免疫组小鼠脾淋巴细胞中CD3+CD8+双阳性T细胞百分数显著增长，而CD3+CD4+双阳性T细胞百分数无显著变化;急性攻击感染的免疫组小鼠的生存时间显著延长;慢性攻击感染，免疫组小鼠脑组织中的Pru包囊数大大下降，减虫率均达80％以上。以上结果表明，弓形虫NTPase-Ⅱ核酸疫苗诱导小鼠产生Th1/Th2混合型并以Th1型为主的免疫反应，对弓形虫的急性感染和慢性感染都起到显著的免疫保护作用。弓形虫NTPase-Ⅱ自杀性DNA疫苗与自主复制型RNA疫苗与相比，除了诱导更强的体液免疫应答，两者在细胞免疫和免疫保护性方面基本没有显著性的差异。 结论： 本实验成功制备了基于SFV甲病毒复制子的弓形虫NTPase-Ⅱ自主复制型RNA疫苗和自杀性DNA疫苗，均能在哺乳动物细胞中表达NTPase-Ⅱ蛋白，都能够诱导强烈的体液免疫和细胞免疫应答，对弓形虫的感染起到了显著的免疫保护作用。因此，基于SFV甲病毒复制子的自主复制型RNA疫苗和自杀性DNA疫苗均能成为弓形虫核酸疫苗的候选载体。