实验目的肿瘤转移是由一系列步骤组成的，包括侵袭周围组织、沿血管或淋巴管运行、在靶器官上增殖等。但肿瘤转移的机制很复杂，目前还没有一个学说能全面的解释肿瘤的转移与浸润现象。要了解肿瘤转移的分子机制就必须要研究肿瘤基因型和表型间的相互关系。人涎腺腺样囊性癌（adenoid cystic carcinoma，ACC）是口腔颌面部常见的涎腺恶性肿瘤，其临床生物学行为突出特征之一就是易发生肺转移，转移率高达40％以上，这种特殊的亲肺现象引起了研究者的极大兴趣。但目前对其转移机理仍了解不多。ACC-2和ACC-M这两种细胞为同一亲本，二者的差异集中在转移表型上，转移性具有显著差异，ACC-M转移率为96％，ACC-2转移率为18％。转移是恶性肿瘤的重要特征，与基因水平上的一系列改变密切相关，肿瘤失去转移特征其恶性度将大大降低，因此对肿瘤转移相关基因的研究是攻克肿瘤不可缺少的重要的基础工作之一。本研究首先应用抑制性消减杂交技术（suppression subtractive hybridization，SSH）筛选ACC肺高、低转移细胞ACC-M和ACC-2中差异表达基因，分析肺高转移细胞ACC-M中的高表达转移相关基因；应用RNA干扰技术对其中的一个转移相关基因XAGE-1b进行基因功能方面的初步研究，探讨XAGE-1b基因在涎腺腺样囊性癌转移中的相关性；此外，还应用实时荧光定量PCR（real-time fluorescent quantitative PCR，FQ-PCR）检测部分头颈恶性肿瘤患者瘤组织标本中XAGE-1b mRNA的表达水平，以进一步探讨该基因在头颈肿瘤转移中的作用。实验方法1.细胞：人涎腺ACC高转移细胞株ACC-M和低转移细胞系ACC-2（上海交通大学附属第九人民医院口外肿瘤实验室提供）。2.mRNA分离纯化和抑制性消减杂交：取RPMI 1640及5％CO₂和双抗条件下培养3天的ACC-2和ACC-M细胞，0.125％胰酶消化。按Trizol试剂说明书抽提总RNA，按OligotexT^M说明书分离mRNA。抑制性消减杂交全部操作按照CLONTECH公司操作手册PT—1117进行。3.差异显示片段的克隆及同源性比较：将差异显示获得的DNA片段纯化，参照pGEM-T Vector Kit操作手册建议的方案设计连接体系。克隆于pGEM-T载体。挑选阳性克隆测序，获得的序列在NCBI的BlastN中进行同源性分析。4.RNA斑点杂交及RT-PCR分析：对抑制性消减杂交中获得的基因序列进一步利用RNA斑点杂交及RT—PCR进行验证是否存在差异表达。5.XAGE-1b基因siRNA表达载体的构建：带有U6启动子的pcDNA3.1siRNA表达载体（复旦大学生命科学学院病毒及分子免疫实验室构建），U6启动子序列按照GenBank序列（ACCession number X06980）化学合成并克隆到pcDNA3.1B（-）载体上，替代原有的CMV启动子，获得所需的siRNA表达载体pcDNA3.1-U6。6.转染：按照Invitrogen的产品说明，用脂质体lipofectamine 2000将XAGE—1b基因干扰质粒和对照质粒分别转染ACC-2和ACC-M细胞，转染干扰质粒的细胞称为ACC2-X，ACCM-X，24—48h后收集细胞，pEGFP质粒作为各组转染效率对照。7.RT-PCR检测XAGE-1b基因干扰效率：抽提转染细胞和对照细胞RNA，取0.6μg总RNA反转录为cDNA，以此为模板检测XAGE—1b基因表达量的改变，G3PDH基因作为对照。8.Boyden小室检测肿瘤细胞体外迁移能力：9.裸鼠体内检测肿瘤细胞转移能力的改变：8w龄雌性BALB／C nu／nu裸小鼠38只，分组，在距尾尖2～3cm处尾静脉注入各组肿瘤细胞悬液0.1ml／只。1w后重复注射1次。8w后处死的裸鼠，无菌条件下解剖取出肺脏。凡肉眼可见转移灶者，显微镜下手术剪剥离，余下肺组织和分离的转移灶用Satorium电子天平分别称重记录，数据应用SPSS 11.5软件单因素方差分析方法（ANOVA）进行统计学处理。10.头颈恶性肿瘤患者标本收集后模板RNA提取：临床收集到的头颈恶性肿瘤患者标本组织总RNA提取按说明书（Invit rogen公司）操作，通过1％甲醛琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计分析RNA质量和浓度。11.实时荧光定量PCR检测标本中XAGE-1b mRNA的表达：每个样本重复2次。计算机自动获取标本中XAGE-1b和GAPDH的Ct值，对照标准曲线计算每个样本XAGE-1b和GAPDH基因的拷贝数。结果以XAGE-1b和GAPDH基因拷贝数的比值表示相对表达量。实验结果1.差异表达基因克隆及同源性比较：本实验以ACC-M为测试子，ACC-2为驱动子进行抑制性消减杂交，在ACC-M中获得了6个相对于ACC-2高表达的差异基因，均为已知基因片段。2.RNA斑点杂交和RT—PCR分析结果：2.1 RNA斑点杂交验证：对获得的差异表达序列以G3PDH为对照用RNA斑点杂交进行半定量验证。结果与SSH结果基本一致。在呈差异表达的基因中，有6个基因在ACC-M细胞中高表达，其表达量是ACC-2的2倍以上。2.2 RT-PCR验证：对肺高转移细胞ACC-M中的编号m-12基因（XAGE-1b gene for cancer-associated protein）经反转录PCR分析，结果均可见有明显扩增条带，同时以G3PDH作内参对照，显示m-12基因在ACC-M细胞中相比于ACC-2细胞呈高表达，根据图象扫描定量分析，在ACC-M和ACC-2细胞中该基因表达量相差达3倍以上。3.干扰质粒转染后RT—PCR验证XAGE-1b基因表达量的改变：以G3PDH为对照检测ACC-M和ACC-2细胞中XAGE-1b基因表达量的改变，同时以空质粒和带有阴性干扰片断的质粒作为对照，转染干扰质粒的细胞中XAGE—1b表达量相比对照质粒中XAGE—1b表达量显著下降。4.Boyden小室检测肿瘤细胞体外迁移能力：XAGE—1b基因干扰后，利用Boyden小室和Matrigel模拟胞外基质检测细胞迁移粘附能力，同时以转染空质粒和阴性质粒的细胞作为对照，结果ACC-2、ACC-M与其它对照组比较有显著性差异（p＜0.01）。5.裸鼠体内肿瘤细胞肺转移能力的改变：注射细胞后每隔1～2d观察小鼠状态，至第8w末处死小鼠，解剖取肺脏，显微镜下分离转移灶。3组裸鼠除肺以外其他部位均未发现结节及淋巴结肿大。XAGE-1b基因干扰后的细胞株在裸鼠体内转移灶肉眼下不可见或数量少而小，肺部转移灶重量均值与对照组比较有显著性差异（p＜0.01）。6.部分头颈恶性肿瘤患者标本扩增产物鉴定及测序结果：XAGE-1b和GAPDH扩增片段经2％琼脂糖电泳，XAGE-1b和GAPDH扩增片段分别为345 bp和500 bp，与理论大小一致。测序结果与GenBank上比对，序列完全一致。7.XAGE-1b在正常组织和头颈恶性肿瘤组织中的表达：ACC、舌癌未转移、舌癌转移、口底癌和喉癌的相对表达量依次为0.0056±0.0070，0.00034±0.00046，0.018±0.021，0.0010±0.0010，0.00051±0.00091，差异有显著性（P＜0.001），由高到低排序为舌癌转移＞ACC＞口底癌＞喉癌＞舌癌未转移，提示XAGE-1b基因表达和转移相关。6份癌旁正常组织和26份头颈恶性肿瘤组织中XAGE-1b对GAPDH的相对表达量均值分别为0.00272±0.005和0.00478±0.011，2组差异有显著性（P＜0.001），用REST软件分析结果，提示头颈恶性肿瘤组织中XAGE-1b表达水平上调。结论1.应用抑制性消减杂交技术筛选到ACC-M中相对于ACC-2的6个差异表达基因，这些基因在ACC-M中的高表达可能是涎腺腺样囊性癌发生转移的主要原因。2.RNA干扰作用抑制了XAGE-1b基因在ACC-M中的表达，在体外实验和体内检测中明显降低了ACC-M细胞迁移黏附以及肺转移能力，初步证实了XAGE-1b基因在涎腺腺样囊性癌转移方面具有重要作用。3.XAGE-1b基因在部分头颈恶性肿瘤组织中表达高于癌旁正常组织。其表达量与头颈鳞癌的淋巴结转移相关。提示在头颈鳞癌的转移过程中，XAGE-1b基因可能发挥了重要作用，可能成为头颈鳞癌淋巴结转移的监测指标之一。