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研究背景与目的脓毒症是病情进展迅速的危重疾病,是战创伤、休克及手术后常见的并发症。脓毒症及其引起的多器官功能障碍是ICU患者死亡的重要因素,目前临床上尚无特异性治疗手段。巨噬细胞是天然免疫的重要组成部分,在炎症启动和病原清除中发挥关键作用。研究发现,巨噬细胞功能障碍伴随着脓毒症的发生发展。在感染的初始阶段,巨噬细胞在各种外来物质的刺激下过度活化,产生大量炎症介质,进而招募激活中性粒细胞,导致系统性全身炎症反应综合征。此外,巨噬细胞通过分泌细胞因子,摄取递呈抗原,从而激活淋巴细胞功能,协同启动获得性免疫反应。在脓毒症中,巨噬细胞过度活化后,会进入功能抑制状态,表现为吞噬功能低下,分泌细胞因子能力降低。近年来研究发现,共抑制分子程序性死亡受体-1(programmed death-1,PD-1)/程序性死亡受体配体-1(programmed cell death ligand-1,PD-L1)信号通路与脓毒症免疫耐受密切相关。通过PD-1或B7H1基因缺陷的小鼠发现,阻断PD-1:B7H1信号通路可以减轻脓毒症引起的脏器损伤,降低血浆炎症因子,增强细菌清除能力,从而改善小鼠的生存期。值得注意的是,在脓毒症中,PD-1和B7H1基因缺陷的小鼠腹腔巨噬细胞功能较野生型小鼠有明显改善,表现为感染局部的数量增多,产生的细胞因子增多;PD-1敲除小鼠的腹腔巨噬细胞吞噬功能明显高于野生型脓毒症小鼠。在脓毒症患者的研究中发现,通过抗PD-L1抗体体外阻断PD-1:B7H1通路,可以改善患者外周血单核细胞的功能,促进其分泌更多的炎症因子。综上,PD-1:B7H1通路在脓毒症时巨噬细胞功能障碍中可能发挥重要的作用,且PD-1基因缺陷或B7H1基因缺陷后对巨噬细胞功能的影响可能有不同之处。PD-1:B7H1在巨噬细胞上表达受何调控,对巨噬细胞的功能和表型有何调节作用目前尚不明确。本课题拟首先利用PD-1基因缺陷和B7H1基因缺陷小鼠,分别通过培养骨髓来源巨噬细胞(Bone marrow derived macrophage,BMDM)和腹腔巨噬细胞(Peritoneal macrophage,PM),研究巨噬细胞分泌细胞因子,抗原递呈相关分子的表达,细胞极化以及吞噬功能的影响及其机制。最后利用PD-1和PD-L1基因敲除小鼠,在体观察基因缺陷后对巨噬细胞活化和表型的影响,并进一步研究其在脓毒症模型中发挥的调节作用。实验对象及方法1、周龄匹配的雄性野生型C57BL/6小鼠,PD-1-/-和B7H1-/-小鼠各8只,处死后收集股骨和胫骨骨髓腔细胞,给予M-CSF集落刺激因子共培养,体外培养7d后获得骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)。周龄匹配的雄性野生型C57BL/6小鼠,PD-1-/-和B7H1-/-小鼠各8只,给予腹腔注射1ml3%巯基乙酸盐,4天后灌洗腹腔,收集腹腔巨噬细胞(PM)。标记F4/80抗体后,流式细胞术检测巨噬细胞纯度。2、对培养成熟的BMDM及腹腔来源的PM,给予不同浓度的LPS刺激24h后,收集上清,ELISA检测细胞因子TNF-α、IL-6、IL-10和IL-12p70的表达水平;周龄匹配的雄性野生型C57BL/6小鼠,PD-1-/-和B7H1-/-小鼠各6只,给予腹腔注射5mg/kg LPS,8h后处死小鼠,收集外周血及腹腔灌洗液,ELISA检测细胞因子TNF-α、IL-6、IL-10和IL-12p70的表达水平。3、对培养成熟的BMDM及PM计数铺板后,给予LPS或IFN-γ刺激24h,流式细胞术检测CD80、CD86、CD40和MHC-II分子的表达;将培养成熟的BMDM分为对照组和IFN-γ刺激组,western-blotting检测细胞STAT-1和STAT-3的磷酸化水平。4、周龄匹配的雄性野生型C57BL/6小鼠,PD-1-/-和B7H1-/-小鼠各12只,随机均分为对照组和CLP组,流式细胞术分别检测腹腔巨噬细胞和脾脏巨噬细胞(Splenic macrophage,SM)表面CD80、CD86、CD40和MHCII分子的表达;收集各组naive小鼠外周血,ELISA检测血浆中IFN-γ和IL-12p70的水平;收集各组naive小鼠的腹腔巨噬细胞,western-blotting检测STAT-4的磷酸化水平。5、对培养成熟的BMDM计数铺板后,给予IFN-γ或IL-4刺激24h后,分别收集总RNA和细胞蛋白,使用实时定量荧光PCR和western blotting检测巨噬细胞极化相关分子i-NOS、Arginase、CD206和YM-1的m RNA和蛋白表达6、对培养成熟的BMDM或PM计数铺板后,分为对照组和LPS刺激组,加入荧光标记的大肠杆菌1h后,流式细胞术检测巨噬细胞的吞噬能力。结果1、利用野生型小鼠,PD-1-/-和B7H1-/-小鼠培养获得的BMDM和PM,生长状态良好,纯度达到80-95%。2、给予低浓度LPS(1ng/ml)刺激时,从PD-1-/-和B7H1-/-小鼠来源的BMDM和PM分泌的细胞因子高于野生型小鼠;当给予高浓度LPS(100ng/ml)刺激时,基因缺陷小鼠来源的巨噬细胞分泌的细胞因子与野生型小鼠组没有明显差异。给予非致死剂量的LPS刺激后,PD-1-/-和B7H1-/-小鼠血浆中TNF-α、IL-6、IL-10和IL-12p70的表达水平均高于野生型小鼠;基因缺陷小鼠的腹腔灌洗液中IL-6和IL-12p70表达水平高于野生型小鼠,TNF-α和IL-10的表达水平过低,检测不出。3、B7H1-/-组BMDM表面CD80和MHC-II表达水平低于野生型对照组,在LPS或IFN-γ刺激后,CD80表达水平仍然显著低于野生型对照组;B7H1-/-组PM表面MHC-II表达水平显著高于野生型对照组。PD-1-/-组PM表面CD80、CD86和MHC-II表达水平显著高于野生型对照组。PD-1-/-和B7H1-/-组巨噬细胞在IFN-γ刺激前后的STAT-1和STAT-3磷酸化水平与野生型组均无显著差异。4、PD-1-/-和B7H1-/-组naive小鼠PM表达更高水平的MHC-II分子,PD-1-/-组PM和SM表面CD80表达水平高于野生型小鼠。PD-1-/-和B7H1-/-小鼠血浆中IL-12p70表达水平高于野生型小鼠组,但IFN-γ的表达水平与野生型小鼠无明显差异;PD-1-/-和B7H1-/-小鼠腹腔巨噬细胞的STAT-4磷酸化水平显著高于野生型小鼠。与对照组相比,脓毒症小鼠腹腔巨噬细胞表面CD86、CD40和MHC-II的表达显著降低;脾脏巨噬细胞表面CD80的表达水平明显升高;与野生型小鼠相比,PD-1-/-和B7H1-/-组脓毒症小鼠表达相当水平的抗原递呈相关分子。5、与野生型小鼠组相比,PD-1-/-和B7H1-/-组BMDM在IFN-γ刺激后表达相当水平的i-NOS m RNA和蛋白;在IL-4刺激后,各组之间Arginase和YM-1的m RNA和蛋白表达均无差异,但B7H1-/-组表达更高水平的CD206蛋白。6、LPS预处理6h后,巨噬细胞的吞噬功能并无明显变化;与野生型小鼠比,PD-1-/-和B7H1-/-组BMDM或PM在LPS刺激前后的吞噬功能均无显著差异。结论PD-1:B7H1通路参与负性调节巨噬细胞在LPS刺激下细胞因子的分泌。PD-1或B7H1基因缺陷可以不同方式影响巨噬细胞的表面抗原递呈相关分子的表达,其调节作用与巨噬细胞的来源和不同的刺激方式相关。PD-1-/-和B7H1-/-小鼠血浆中表达明显升高的IL-12p70,其可能通过STAT-4通路调节抗原递呈相关分子的表达。PD-1:B7H1通路不直接影响巨噬细胞的极化和吞噬功能。