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颗粒溶素(Granulysin,GNLY)和穿孔素(Perforin,PFP)是存在于NK细胞和CTL细胞中的细胞毒蛋白,广泛参与机体抗病原微生物感染和抗肿瘤免疫,有望成为理想的抗肿瘤、抗结核药物。颗粒溶素和穿孔素的表达与癌症、感染、器官移植等多种疾病都有密切关系,深入进行颗粒溶素和穿孔素的研究对许多重大疾病的诊断及治疗都有非常重要的意义。本实验运用基因工程的方法体外获取颗粒溶素和穿孔素基因片段,利用原核表达体系合成不同分子量的颗粒溶素融合蛋白,为颗粒溶素的后续研究创造条件;构建颗粒溶素和穿孔素真核共表达载体并转染人肺腺癌A549细胞,体外观察颗粒溶素和穿孔素在肺癌细胞中的表达情况,为进一步探索颗粒溶素和穿孔素在肿瘤治疗中的应用提供依据。主要研究方法及结果:1.体外分离并培养外周血单个核细胞,抽提总RNA,RT-PCR扩增人颗粒溶素和穿孔素基因片段,将其插入pMD18-T构建克隆载体,测序结果表明人颗粒溶素和穿孔素基因片段与Genbank中序列一致,构建了pMD-GNLY和pMD-PFP。2.构建原核表达质粒pET-GNLY9K和pET-GNLY15K,将重组质粒转入大肠杆菌Rosetta(DE3),经IPTG诱导在原核表达系统中高效表达了相应分子质量约为31和37kD的融合蛋白,Western-blotting结果表明重组颗粒溶素融合蛋白能与羊抗人颗粒溶素抗体发生良好的抗原抗体反应。3.以FMDV2A代替IRES,构建真核共表达载体pGNLY-2A-PFP并转染人肺癌A549细胞,RT-PCR和间接免疫荧光检测目的蛋白表达,流式细胞AnnexinV/PI检测转染后细胞凋亡情况。重组质粒转染A549细胞后检测出了目的基因mRNA及蛋白的表达,pGNLY-2A-PFP转染后细胞死亡率高于其他对照组(P＜0.05),死亡细胞以凋亡为主。结论及研究意义:1.成功获取了颗粒溶素和穿孔素基因片段,为颗粒溶素和穿孔素的后续研究创造了条件。2.利用原核表达体系成功地表达了不同分子量的颗粒溶素融合蛋白,为颗粒溶素的后续研究奠定了基础。3.人颗粒溶素和穿孔素基因可以在人肺癌A549细胞中表达,二者共表达能够促进细胞凋亡,这将有助于颗粒溶素和穿孔素在肿瘤治疗中应用的后续研究。