类膨胀素TrSwol和BsEXLX1在毕赤酵母中的优化表达和功能特性研究

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能源问题一直是全球关注的热点问题之一。随着不可再生能源的日益减少,如何高效地利用地球上最为丰富的木质纤维素资源生产生物燃料,已成为世界各国的研究焦点。然而,木质纤维素的结晶度高、纤维素酶降解天然底物低效率导致生产的高成本,这已成为生物质有效转化和高效利用的瓶颈。  类膨胀素蛋白是一类能够通过破坏纤维素的晶体结构加强纤维素酶的活性的蛋白,与植物膨胀素结构和功能类似。因而这类蛋白的发现对于高效降解纤维素具有十分重要的意义。真菌瑞氏木霉(Trichoderma reesei)的TrSwol和细菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的BsEXLX1能破坏纤维素结构、加强纤维素酶的活性,然而,它们的表达水平是有限且一些重要生化特性仍然没有被揭示。  本研究成功地将真菌瑞氏木霉的类膨胀素基因TrSwol和细菌枯草芽孢杆菌的类膨胀素基因BsEXLX1在毕赤酵母中表达,考察了培养时间、甲醇浓度、培养基初始pH和蛋白酶抑制剂的添加对重组类膨胀素蛋白TrSwol和BsEXLX1表达的影响。蛋白酶抑制剂PMSF和商业化的蛋白酶抑制剂混合物显著地改善了两种重组蛋白的产量,而EDTA对重组蛋白的产量没有明显的影响。经过优化表达条件, TrSwol的最高表达水平达到了约120 mg l-1,几乎是它在其它宿主最高表达水平的2.4倍。BsEXLX1的最高表达水平也达到了860 mg l-1,是以前报道的最高表达水平的86倍。另外,我们通过Ni-NTA His-bind树脂纯化了两种重组蛋白以定量地比较两种蛋白的协同活性和考察它们的未知的生化特性。在水解滤纸的过程中,重组的TrSwol和BsEXLX1都与内切纤维素酶协同作用增加还原糖的释放量,且产生的最大还原糖数量几乎分别是对照组(反应混合物中不含类膨胀素蛋白)的2.0倍和2.5倍。在几种酶解条件下,TrSwol的协同活性都是高于BsEXLX1,说明与BsEXLX1相比,TrSwol展现了更强的纤维素破坏活性。类膨胀素浓度对协同活性有一定的影响,当每克滤纸对应1 mg类膨胀素蛋白的使用量时,协同作用达到了最大水平。在50℃、70℃和90℃,两种重组蛋白都显示了相当高的热稳定性,甚至在100℃预处理1 h之后,两种重组蛋白还能保持大于45%的活性,说明它们具有显著的耐热性。另外,它们也对变性剂尿素和SDS有一定的抵抗性。本研究优化了TrSwol和BsEXLX1的生产,并且揭示了它们的热稳定性等生化特性,这为类膨胀素蛋白的工业应用提供了有价值的线索。
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