目的三叶青是我国特有濒危珍稀药用植物,在抗肿瘤、抗炎和调节免疫力等方面具有广泛的药理活性。不同产区的三叶青药材的质量和市场销售价格差异较大,但缺乏准确的评价和鉴别方法,制约阻碍了三叶青产业的健康发展。本研究以不同产区的三叶青药材为研究对象,利用指纹图谱和叶绿体全序列分析的方法,从化学成分和分子标记两个层面,对浙江、广西和福建等不同产地的三叶青的质量进行评价,开发种属特异性的高效叶绿体DNA条形码对其进行准确鉴别。方法1.基于指纹图谱结合化学模式对不同产地三叶青药材的质量评价:采集不同产区的三叶青药材,在单因素试验的基础上,以总黄酮得率为评价指标,运用Box-Behnken响应面法优化三叶青总黄酮的提取工艺;建立不同产地的三叶青总黄酮的HPLC指纹图谱,利用相似度评价、聚类分析和主成分分析等化学计量学方法对不同地区三叶青药材进行质量评价分析。2.三叶青叶绿体基因组全序列测定与分子进化关系研究:采集不同产区品种,采用二代测序的方法获得三叶青叶绿体基因组全序列信息,并与葡萄科的其他代表物种进行了比较分析,揭示了它们在基本基因组结构、密码子使用偏向、重复结构特征和红外扩展等方面的保守和不同特征,增进了对三叶青叶绿体基因组的多样性及葡萄科物种系统发育关系的理解,明确不同产区三叶青药材叶绿体高变位点区域。3.三叶青叶绿体基因组全序列的分子鉴别技术研究:根据不同产区三叶青叶绿体的高变位点区域,在其两侧保守位点序列中设计开发特异性的DNA条形码,PCR扩增检测设计开发条形码扩增效率;结合通用性的DNA条形码核基因ITS2和叶绿体基因rbcL、trnL-F和psbA-trnH序列,采用PCR扩增的方法获得不同产区三叶青样品叶绿体特异性DNA条形码序列,测序后将双向拼接结果与Genbank数据库中的序列进行BLAST对比,通过Blast对所得序列的准确性和方向进行确认,使用MEGA7软件计算各序列的碱基组成比例,并以K2P模型计算三叶青在地区内和地区间遗传距离,基于K2P模型,构建neighbor-joining（NJ）系统发育树,设计两个特殊的DNA条形码来识别三叶青的产地。结果1.建立了全国9个不同产地的18批三叶青总黄酮HPLC指纹图谱。本研究三叶青药材的1 1个共有峰中,分别成功指认出5号峰为芦丁,10号峰为槲皮素,1 1号峰为山柰酚,其均有三叶青的药理活性密切相关。运用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）”进行分析时发现,不同产地三叶青相似度不高,差异最大的地区与对照图谱的相似度仅为0.77。同时各产地三叶青样品共有峰相对保留时间的RSD值差异较小,但相对峰面积的RSD值差异较大,表明不同产区三叶青样品其化学成分近似,但同一化学成分含量差异较大。由指纹图谱可知浙江台州产三叶青各化学成分最为丰富,且各成分含量也较高;贵州黔西南产三叶青次之;其中以湖南永州与广东清远化学成分种类与含量均为最低。聚类分析与主成分分析结果一致显示,18批三叶青样品可聚为4类。其中主成分结果表明,峰5（芦丁）、6、7、9、10（槲皮素）、11（山柰酚）与三叶青药材质量存在一定的相关性。2.高通量测序结果显示,不同产地的三叶青叶绿体基因组结构高度保守,均由一个大的单拷贝区、一个小的单拷贝区和一对反向重复区组成,序列的长度为160,124 bp（江西）至160,618 bp（浙江）之间。三叶青的叶绿体基因组共编码112个独特的基因,包括80个蛋白编码基因,28个tRNA基因和4个rRNA基因,不同产地三叶青的基因顺序、内容和结构高度相似。IR区边界的扩张与收缩分析显示,三叶青叶绿体的收缩/扩展事件均发生在ycf1、rps19和rp12基因的连接处,但不同产区的收缩和扩展的程度不同,导致了三叶青和葡萄科植物的基因组大小的差异。不同产地的三叶青叶绿体中共鉴定发现SSR标记数量为56-57个,在五个不同地区的样品中表现出多种差异。对三叶青和葡萄科的叶绿体基因组进行比较分析,共发现了5个高变的间隔,包括4个基因间隔区和一个蛋白编码基因（ycf1）。基于保守的叶绿体基因组蛋白的系统发育分析,将五个不同产区的三叶青物种归入一个支系,与同属的扁担藤呈姐妹关系。3.对不同地区的三叶青叶绿体基因组分析,共发现五个高突变位点,包括accD,trnL,trnN,ndhD-psaC and ndhC-trnV基因。PCR扩增结果表明,trnL和trnN基因为基础的DNA条形码在不同产地三叶青中显示了最高的扩增和测序的效率,三叶青样本中trnL和trnN条形码大小分别为1143bp和469bp.对6个不同地区的21份三叶青样品进行trnL和trnN条形码的测定分析,发现两个开发设计的条形码在不同地区间表现出一定的差异性,NJ树分析结果表明,trnL和trnN分子标记组合可将来自6个不同地区的三叶青样品聚为3组,并成功将四川地区和浙江地区的三叶青样品与其他地区分离。结论1.采用指纹图谱结合化学模式识别,能够客观、整体、全面地反映不同产地三叶青的差异,为不同产区的三叶青药材的质量评价和鉴别技术开发奠定了基础。2.不同地区三叶青样品在SSR数量、IR边界和高变位点等存在一定差异,具有大量种内变异位点的高变区为区分三叶青的产地提供了潜在的DNA条形码序列。3.基于不同区域的三叶青叶绿体基因组热点,成功构建了 trn1和trnN的叶绿体分子标记,可将部分地区的三叶青样品进行准确鉴别区分,能够为三叶草药材质量的控制和市场规范管理提供技术保障,并为不同产区药材特征性分子标记技术和道地性研究提供借鉴参考。