胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells,ESCs)由于其特性,即在分化为其他不同类型细胞的同时还能保持自己不断更新的状态而成为科学家们重点关注的对象。目前关于胚胎干细胞的研究中最多的是小鼠胚胎干细胞(mouse ESCs,mESCs),我们先前研究表明CP2家族转录因子Tfcp2l1(Transcription factor CP2-like protein 1)是mESCs维持自我更新的一个重要基因。Tfcp2l1是自我更新相关信号通路LIF/STAT3、Wnt/β-catenin以及FGF/MEK/ERK的共同靶点。Tfcp2l1转录本的上调能够代替细胞因子LIF或Wnt/β-catenin信号激动剂和FGF/MEK/ERK通路的抑制剂(CHIR99021和PD0325901,即2I)介导的自我更新促进作用。更重要的是,与LIF/STAT3信号通路的其他靶基因相比,只有下调Tfcp2l1才有可能削弱LIF介导的自我更新作用。此外,Tfcp2l1能够将小鼠外胚层干细胞(mouse Epiblast Stem Cells,mEpiSCs)重编程回到mESCs状态。因此,Tfcp2l1已成为维持和诱导胚胎干细胞多能性的核心分子。到目前为止,许多与Tfcp2l1相关的效应因子已经被鉴定出来,如Tfcp2l1与MTA1蛋白相互作用抑制分化细胞的出现,同时刺激Esrrb的表达以实现LIF非依赖性的mESCs自我更新。但关于Tfcp2l1蛋白稳定性调控的确切机制尚不清楚,在这里我们发现了一种精确控制Tfcp2l1蛋白稳定性的新机制。根据人蛋白质参考数据库(http://www.hprd.org/)预测,Tfcp2l1可能与β-TrCP1(β-transducin repeat containing protein 1)具有相互作用,因为β-TrCP1是泛素连接酶,所以为了验证该预测,我们首先用蛋白酶体抑制剂MG-132处理细胞,结果显示处理过的细胞中Tfcp2l1蛋白的稳定性提高,这表明Tfcp2l1确实是通过泛素化—蛋白酶体途径降解的。为了进一步探究β-TrCP1对Tfcp2l1的调节作用,我们分别从过表达和敲低两个方面检测Tfcp2l1的蛋白量变化。结果显示,β-TrCP1基因的上调不影响Tfcp2l1的转录水平,但会降低Tfcp2l1蛋白水平,而β-TrCP1表达下调后Tfcp2l1的蛋白水平则显著增加,转录水平不变。由于β-TrCP2和β-TrCP1都是泛素连接酶E3的关键成分,因此,我们检测了β-TrCP2对Tfcp2l1的调控作用,β-TrCP2对Tfcp2l1蛋白的调控弱于β-TrCP1。以上结果表明Tfcp2l1蛋白的稳定性主要由β-TrCP1控制。在确定了β-TrCP对Tfcp2l1的调节作用后,我们接下来从蛋白水平进行检测两者是否具有直接的相互作用。首先我们准备了两株都过表达了带有FLAG标签的Tfcp2l1基因的细胞,同时这两株细胞再分别过表达带有HA标签的β-TrCP1和β-TrCP2,免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)和蛋白免疫印迹实验表明它们之间确实存在直接的相互作用。接着我们将β-TrCP1在Tfcp2l1蛋白上的保守结合位点(DSGDNS)突变为(DAGDNA),再转入细胞,同样的进行了免疫共沉淀实验,结果显示Tfcp211突变体结合β-TrCP1的强度弱于野生型Tfcp2l1。基于泛素化检测实验,我们发现在分别过表达野生型和突变型的Tfcp2l1细胞中,增强β-TrCP1的活性泛素化野生型Tfcp2l1蛋白要强于Tfcp2l1突变体,说明β-TrCP1通过泛素化将Tfcp2l1蛋白降解,同时免疫荧光的实验显示β-TrCP1对Tfcp211蛋白的修饰主要发生在细胞质中。β-TrCP1结合Tfcp2l1蛋白保守基序(DSGDNS)里的丝氨酸接着必须事先被磷酸化,根据http://www.hprd.org/网站预测的结果,我们发现激酶MK2(MAP kinase-activated protein kinase 2)涉及这一过程。为了明确Tfcp2l1的稳定性是否受MK2控制,我们进行了三个实验。第一,通过过表达HA标记的MK2,我们发现MK2基因的过表达导致了Tfcp2l1蛋白水平的降低。第二,通过添加MK2抑制剂,我们发现Tfcp2l1蛋白水平逐渐增加。第三,通过将MK2转录本敲低,我们观察到MK2的下调导致了Tfcp2l1蛋白在mESCs中积累。这些结果表明MK2是Tfcp2l1蛋白的一种新的负调控因子。为了验证MK2是否直接调控Tfcp2l1,我们同样进行了免疫共沉淀技术探究MK2激酶对β-TrCP1和Tfcp2l1之间关系的影响,我们准备了两株同样过表达Tfcp2l1的细胞系,其中一株用MK2抑制剂进行处理,发现用抑制剂处理的细胞两个蛋白质之间的相互作用却减少了。同时我们发现过表达MK2基因可以增强Tfcp2l1蛋白的磷酸化水平,但是用MK2抑制剂处理会降低这一磷酸化水平。另外MK2磷酸化Tfcp2l1突变体的水平也显著低于野生型Tfcp2l1。这些研究表明MK2主要通过磷酸化Tfcp2l1蛋白而介导后者和β-TrCP的相互作用。由于Tfcp2l1在维持小鼠胚胎干细胞的自我更新中发挥重要作用,所以我们最后检测了β-TrCP1和MK2对Tfcp2l1功能的影响。我们设计并操作了如下实验。首先,培养FLAG-Tfcp2l1与HA、HA-β-TrCP1或HA-β-TrCP2共转染的mESCs,在不含LIF的血清培养基中培养8天后,碱性磷酸酶活性检测显示在过表达Tfcp2l1基因的情况下,诱导产生阳性克隆数量的能力大小为HA>β-TrCP2>β-TrCP1,说明β-TrCP1对Tfcp211的负调控效应强于β-TrCP2;接着,我们在mESCs中分别过表达空载对照以及野生型和突变型Tfcp2l1,结果显示维持碱性磷酸酶阳性克隆数量的能力强弱为Tfcp2l1变变体>野生型Tfcp2l1>空载对照。为了确定MK2对Tfcp2l1的功能调节作用,我们在mESCs中过表达MK2,并且在有LIF存在的条件下进行培养,发现MK2会削弱LIF促进自我更新的功能。相反,MK2的抑制剂会增强mESCs的自我更新能力。最后我们将携带野生型或突变型Tfcp2l1的质粒分别导入MK2基因过表达的mESCs中,在没有LIF的条件下进行培养8天,结果显示MK2会削弱野生型Tfcp2l1促进自我更新的能力,但不影响突变型Tfcp2l1的能力。以上结果说明:增强MK2和β-TrCP1会抑制Tfcp2l1促进mESCs自我更新的能力。综上所述,β-TrCP和MK2对Tfcp2l1的蛋白水平起负调控作用,进而诱导mESCs的分化。揭示这一机制扩大了干细胞内多能性因子的调控网络,有助于干细胞未来的基础研究和转化应用。