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研究目的通过研究hASCs和BC膜的生物相容性,以及前者向成骨方向诱导分化的特性来初步探讨hASCs和BC作为骨组织工程种子细胞和支架材料的可行性。研究方法1. hASCs传代培养；2.扫描电镜(SEM)观察BC膜超微结构；3.倒置显微镜观察hASCs的生长形态特征；4. CCK-8检测hASCs在BC膜上的增殖；5.冰冻切片/HE染色,及SEM观察hASCs在BC膜上的粘附；6.倒置显微镜观察hASCs成骨诱导分化过程中的生长形态特征；7. Von Kossa染色、茜素红染色、碱性磷酸酶(ALP)染色检测hASCs的成骨诱导分化；8. RT-PCR检测hASCs在不同培养条件下成骨诱导分化中成骨标志物Osteopontin (OPN)、Osteocalcin(OC)、和ALP的表达产物,电泳后测条带灰度,计算OC/GAPDH、OPN/GAPDH和ALP/GAPDH灰度的比值代表以上基因的相对表达量；9.分别比较OPN、OC、ALP基因在不同培养条件下的表达差异；分析上述三种基因表达相互之间的联系。研究结果1.大体上BC膜呈乳白色半透明胶状,外表均匀光滑；扫描电镜下可见细菌纤维素膜呈超微细网状结构,呈现出良好的纳米纤维网络特征；2. hASCs在细菌纤维素膜表面贴附后呈长梭形,随着时间延长,细菌纤维素膜表面细胞数量逐渐增多,形态仍然保持长梭形。到9d时细胞融合成片；3. hASCs-BC膜复合培养物冰冻切片及HE染色可见细胞呈续的单层贴附生长于细菌纤维素膜表面,接触紧密,且未见hASCs长入材料内部；4.扫描电镜观察可见hASCs呈长梭形,边缘伸出突触,贴附于细菌纤维素膜生长；5. hASCs在细菌纤维素膜表面的增殖良好,细胞对数生长期约在3-9天；6.脂肪间质干细胞成骨分化过程中刚贴壁时仍呈长梭形或椭圆形,之后细胞形态逐渐开始出现短梭形和多角形等。随着诱导时间的延长,由梭形变为立方形、锥形,并有明显胞浆突出,出现多角形成骨样细胞,胞质颜色变深,含粗大颗粒,胞核明显从胞浆伸出许多丝状伪足,并可见明显不透光矿化结节；7.在诱导培养基的条件下,细胞von Kossa染色hASCs在细胞培养板和BC膜上均呈现阳性反应,细胞内大可见量的黑色的矿化物质存在。普通干细胞培养基培养的条件下均呈阴性反应。且同样培养基条件下组间大体上无明显差异；8.在诱导培养基的条件下,细胞茜素红染色hASCs在细胞培养板和BC膜上均呈现阳性反应,可见大量的呈现桔红色的钙沉积阳性细胞。普通干细胞培养基培养的条件下均呈阴性反应。且同样培养基条件下组间大体上无明显差异；9.在诱导培养基的条件下,ALP染色hASCs在细胞培养板和BC膜上均呈现阳性反应,可见明显的染成蓝黑色的胞浆,细胞核为深蓝色。普通干细胞培养基培养的条件下BC膜组细胞胞浆似见较弱的蓝染；10.RT-PCR检测成骨相关基因表达结果显示：第2周(依次为：0.89±0.09；0.72±0.12：0.43±0.06：0.47±0.05)和第4周(依次为：1.51±0.10；1.47±0.12；1.20±0.15；1.18±0.09)所有细胞均有ALP表达,但成骨诱导分化组明显高于普通培养基组(P<0.001)。OC和OPN在第2周均无明显表达,在第4周OPN有较明显的表达(依次为：0.51±0.09；0.48±0.07；0.11±0.030.10±0.02),OC微弱表达(依次为：0.33±0.09；0.30±0.12；0.12±0.06；0.10+0.05)且同样培养基条件下组间无明显统计学差异(P>0.05)；11.成骨诱导过程中OC、OPN和ALP表达之间存在较强的正相关性(分别为：r=0.998,P=0.002；r=0.959,P=0.04；r=0.965,P=0.04)。研究结论1.细菌纤维素膜具有独特的纳米超微结构,hASCs能在其表面良好的增殖和贴附,具有良好的生物相容性；2.利用含抗坏血酸、 β—甘油磷酸和地塞米松的诱导培养基能将hASCs在普通细胞平板上成功的进行成骨诱导分化；3.利用含抗坏血酸、β—甘油磷酸和地塞米松的诱导培养基能将hASCs在细胞纤维素膜上成功的进行成骨诱导分化；4.成骨诱导过程中,hASCs形态发生明显转变；5.成骨诱导过程中,ALP、OPN、OC有着明显的时间表达特征；6.成骨诱导过程中,成骨标志物OC、OPN和ALP表达之间存在较强的正相关性；7. hASCs的成骨分化在细胞培养平板和细菌纤维素膜上没有明显统计学差异。