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【研究背景及目的】有研究报道育龄期女性心血管事件的发生率明显低于相同年龄段的男性,但在绝经后女性中显著升高。绝经后女性的心血管疾病的发生率与同年龄段男性相比无明显差异,高血压、心力衰竭和中风等心血管事件的发生率是未绝经时的2-3倍。因此探索绝经后女性心血管事件发生及发展的影响因素,以及提供相应的防治策略对女性生命健康具有重要意义。交感神经活动亢进(sympathetic hyperactivity)是绝经后心血管疾病的主要特征之一,并且交感的亢进程度对于绝经后心血管事件的发生发展及预后有着直接的影响。头端延髓腹外侧区(rostral ventrolateral medulla,RVLM)是控制交感神经活动水平的主要中枢,有研究发现RVLM核团的毁损将会导致交感神经活动的显著降低。而绝经后RVLM内肾素-血管紧张素系统(renin angiotensin system,RAS)与中枢交感神经亢进和外周高血压的产生密切相关,血管紧张素II(angiotensin II,Ang II)作用于RVLM内前交感神经元上的AT1受体从而调控前交感神经元的兴奋性,AT1受体是一种G蛋白偶联受体(G protein coupled receptor,GPCR)。β-arrestin具有抑制GPCR信号转导的作用,能够介导AT1受体的内吞,并能降低AT1受体的敏感性,从而发挥其对心血管保护作用。相关研究报道,在外周,心肌细胞中β-arrestin可以通过抑制NADPHase减少ROS(reactive oxygen species)的生成进而抑制氧化应激水平,具有心血管保护作用;另有研究表明,在子痫前期小鼠模型中,β-arrestin1也可以通过其偏倚性信号通路(biased signaling)发挥其心血管保护作用,从而改善子痫前期高血压。除了介导GPCR脱敏、内吞及降解的功能外,近年来众多研究学者发现β-arrestin还能够与GPCR下游信号分子结合,形成其特有的信号传导通路,发挥与传统GPCR介导的信号通路不同的效应。近年来β-arrestin成为研究人员的关注热点,并且成为心血管功能调控领域的关键分子。自发性高血压大鼠模型RVLM内β-arrestin1表达水平显著降低,致使交感神经活动亢进和血压升高,在其RVLM内过表达这一蛋白分子具有改善交感神经亢进和高血压的作用。本研究发现,手术绝经后大鼠RVLM内β-arrestin1蛋白的含量明显降低,补充雌激素后出现显著上升。那么绝经后大鼠雌激素水平的降低是否能够通过影响RVLM内β-arrestin1蛋白的含量进而影响心血管功能呢?尚未有研究报道。所以我们的首要目标就是阐明RVLM内β-arrestin1在绝经后交感亢进中的作用及其机制。β-arrestin1在调控多种转录因子表达的同时也受到其他转录因子的调控,有趣的是,有研究表明β-arrestin1能够调控AP-1的亚基c-Fos的表达,而另有研究证明β-arrestin1的表达也受到转录因子AP-1的调控。经典的雌激素信号传导通路中,雌激素作为类固醇激素能够透过细胞膜与其核受体结合后形成复合物,进而与特定靶基因结合从而调控其表达。而在非经典通路中,转录因子AP-1与靶基因结合后,雌激素可直接结合在AP-1上,进而间接发挥其对靶基因的调控作用。因此,我们的第二个研究目标是明确RVLM内AP-1是否介导了绝经后雌激素对β-arrestin1的调控作用。综上所述,我们的整体研究目标是明确绝经后雌激素水平的降低是否通过影响RVLM内β-arrestin1的表达,从而影响交感神经活动水平,进而导致血压水平增高;并进一步阐明AP-1是否介导了雌激素对RVLM内β-arrestin1生成的影响。【研究方法】采用双侧卵巢切除术(ovariectomy,OVX)建立绝经大鼠模型,而Sham组大鼠只开腹不切除卵巢。补充雌二醇的大鼠予术后4周于大鼠颈部皮下注射雌激素(溶剂为0.9%氯化钠溶液,剂量为30μg/kg/d),持续补充雌激素时间为4周,对照组注射生理盐水。麻醉状态下股动脉插管测量大鼠血压及心率,分离肾交感神经记录交感神经放电水平,采取大鼠血浆使用Elisa检测血浆中雌激素及去甲肾上腺素含量。处死大鼠后,断头后取出脑组织提取RVLM组织,使用Western Blot方法比较每个组织样本内β-arrestin1、AP-1表达水平。通过脑立体定位仪及微量注射仪,向RVLM内注射腺相关病毒过表达β-arrestin1及抑制AP-1的表达,通过核团注射小干扰RNA抑制β-arrestin1表达。【研究结果】一、OVX大鼠RVLM内β-arrestin1的表达量降低,补充雌激素能够增加β-arrestin1的表达。OVX大鼠相较于Sham大鼠,血压水平明显升高(156.1±14.1 vs.119.9±10.3mm Hg,n=5,P<0.05),肾交感神经放电水平明显升高(23.99±1.39 vs.13.17±1.57%max,n=5,P<0.05);OVX大鼠补充雌激素后较未补充雌激素的大鼠血压水平显著下降(124.4±8.7 vs.156.1±14.1 mm Hg,n=5,P<0.05),肾交感神经放电水平亦显著下降(15.23±1.01 vs.23.99±1.39%max,n=5,P<0.05)。其RVLM内β-arrestin1蛋白的表达量明显降低(63%);而补充雌激素的OVX大鼠相较于未补充雌激素的OVX大鼠,RVLM内β-arrestin1蛋白的表达量明显升高(60%)。二、OVX大鼠RVLM内过表达β-arrestin1蛋白改善绝经后交感神经亢进及高血压。OVX大鼠RVLM内注射携带arrb1基因的腺相关病毒过表达β-arrestin1,其对照组RVLM内微量注射携带GFP基因的腺相关病毒。发现OVX大鼠RVLM内注射携带arrb1基因的腺相关病毒相比于注射携带有GFP基因的腺相关病毒,其肾交感神经放电水平明显降低(12.82±0.87 vs.19.22±1.66%max,n=5,P<0.05),血压水平明显降低(98.08±3.99 vs.136.6±6.38 mm Hg,n=5,P<0.05)。三、OVX大鼠RVLM干扰β-arrestin1减弱雌激素对心血管功能的保护作用相比于对照组,同样持续性补充雌激素,OVX大鼠RVLM内注射β-arrestin1的小干扰RNA后,其肾交感神经放电水平(10.47±0.84 vs.19.68±0.97%max,n=5,P<0.05)和血压水平(104.8±1.83 vs.138.1±5.348 mm Hg n=5,P<0.05)明显增高。提示OVX大鼠在补充雌激素后抑制RVLM内β-arrestin1的表达,将会减弱雌激素对绝经后交感神经亢进及高血压的改善作用。四、OVX大鼠RVLM内抑制转录因子AP-1的表达,雌激素促进RLVM内β-arrestin1表达的作用消失。OVX大鼠RVLM内注射腺相关病毒抑制AP-1的表达后,相比于对照组,两组同样补充雌激素,RLVM内β-arrestin1蛋白的含量没有显著变化。提示雌激素是通过转录因子AP-1促进RLVM内β-arrestin1表达水平增加的。【研究结论】绝经后大鼠RVLM内β-arrestin1蛋白含量的显著降低与雌激素水平的下降相关,而RVLM内该蛋白含量的降低能够导致交感神经活动亢进和血压升高;转录因子AP-1可能介导了雌激素对绝经后大鼠RVLM内β-arrestin1的调节作用。