【摘 要】
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【背景】动脉粥样硬化（Atherosclerosis,As）主要好发于血管弯曲和分叉处,这些部位为低剪切应力（Low shear stress,LSS）区。血管内皮细胞（Vascular endothelial cells,VECs）是剪切应力的重要传感器,但剪切应力对VECs的影响及其调控机制作用有待进一步的认识。通过谱系追踪表明,As斑块中的间充质细胞为内皮细胞转化而来,表明内皮间质转化（En
【基金项目】
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国家自然科学基金（No.31870937, 82000421）)； 湖南省自然科学基金项目（2020JJ4076）；
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【背景】动脉粥样硬化（Atherosclerosis,As）主要好发于血管弯曲和分叉处,这些部位为低剪切应力（Low shear stress,LSS）区。血管内皮细胞（Vascular endothelial cells,VECs）是剪切应力的重要传感器,但剪切应力对VECs的影响及其调控机制作用有待进一步的认识。通过谱系追踪表明,As斑块中的间充质细胞为内皮细胞转化而来,表明内皮间质转化（Endothelial-mesenchymal transition,EndMT）在As病变进程中扮演着重要的作用。且低剪切应力可诱导内皮细胞发生EndMT,对As的进展起着重要推动作用。本课题组前期研究表明,DNA羟甲基化酶TET2（Tet methylcytidine dioxygenase 2,TET2）为剪切应力敏感基因,低剪切应力下调TET2表达。ATP5A1基因编码ATP合成酶α-亚基,介导线粒体中氢离子转运,负责将呼吸链中的ADP合成为ATP。在本研究中,我们将探讨TET2/ATP5A1在低剪切应力下促EndMT中的作用及机制。【目的】探讨低剪切应力诱导VECs EndMT的调节机制。【方法】1.采用平行平板流动腔系统,探讨低剪切应力对人脐静脉血管内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）TET2及EndMT的影响。2.慢病毒转染技术构建TET2低表达HUVECs,荧光显微镜和Western blot技术检测其转染效率,Western blot检测TET2 sh RNA对ATP5A1表达和EndMT的影响。3.BSAS技术检测TET2是否通过羟甲基化修饰作用调控ATP5A1的表达。4.慢病毒转染技术分别构建ATP5A1过表达和低表达的HUVECs,荧光显微镜和Western blot技术检测其转染效率,Western blot检测对EndMT的影响,细胞划痕实验检测对细胞迁移的影响。5.Western blot检测TET2 sh RNA以及过表达和低表达ATP5A1的HUVECs对代谢相关蛋白葡萄糖转运蛋白1（glucose transporter type 1,GLUT1）,丙二酰辅酶A脱羧酶（malonyl-Co A decarboxylase,MLYCD）表达的影响。6.采用平行平板流动腔系统,在低剪切应力条件下干预ATP5A1,探讨对血管内皮细胞GLUT1,MLYCD以及EndMT的影响。【结果】1.低剪切应力下调内皮细胞标志物CD31,VECadherin的表达,上调间质细胞标志物vimentin,α-SMA的表达并下调TET2的表达,表明低剪切应力下调TET2的表达,并诱导EndMT。2.TET2 sh RNA下调内皮标志物CD31,VECadherin的表达,上调间质细胞标志物vimentin,α-SMA的表达,ATP5A1的表达。表明TET2 sh RNA促EndMT并上调ATP5A1的表达。3.BSAS检测结果显示TET2对ATP5A1羟甲基化无明显影响,表明TET2通过非羟甲基化作用调控ATP5A1。4.LV ATP5A1促进vimentin的表达,细胞迁移能力增加,表明LV ATP5A1促EndMT。ATP5A1 sh RNA下调vimentin的表达,细胞迁移能力减弱,表明ATP5A1 sh RNA抑制EndMT。5.TET2 sh RNA促进GLUT1,MLYCD的表达,LV ATP5A1促进GLUT1,MLYCD的表达,ATP5A1 sh RNA下调GLUT1,MLYCD的表达,表明TET2通过上调ATP5A1的表达促进代谢改变。6.在低剪切应力下调ATP5A1的表达,对vimentin,GLUT1,MLYCD的表达无明显影响。【结论】低剪切应力下调TET2的表达,上调ATP5A1的表达,介导细胞代谢改变及vimentin表达,促EndMT。
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