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目的:
研究硼替佐米诱导多发性骨髓瘤RPMI8226细胞的钙超载机制,揭示钙超载与多发性骨髓瘤细胞凋亡的关系。观测诱导前后钙超载的变化是否与硼替佐米作用于神经细胞的凋亡结果一致,是否有嗜神经细胞毒性,有助于我们更好地认识周围神经病变发生的相关分子机制,为神经病变的治疗提供新的角度。
方法:
1、细胞复苏及培养
于-80℃冰箱内取出冻存的多发性骨髓瘤RPMI8226细胞,迅速放入37℃恒温水浴箱中解冻,解冻后将冻存管中液体移入培养瓶,置于37℃的5%CO2培养箱中培养,24h后换液。多发性骨髓瘤细胞RPMI8226悬浮生长于加10%的胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI1640培养液中,置于37℃的Co2培养箱中培养。每2-3天换液一次,取对数生长期细胞用于实验。
2、CCK-8法检测硼替佐米对骨髓瘤细胞的增殖抑制率
以多发性骨髓瘤细胞RPMi8226细胞为实验对象,试验分6个组,不加药对照组、100、200、300、400、500nmol/l硼替佐米组,硼替佐米作用24h后,应用CCK-8法检测不同浓度硼替佐米作用后细胞的增殖情况。
3、AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞技术检测细胞凋亡率
根据流式细胞技术原理,将待测多发性骨髓瘤细胞RPMI8226细胞以1×106个/ml接种,分别用不同浓度硼替佐米(200、300nmol/L)干预,同时设立空白对照组,置于细胞培养箱培养24h,收集细胞,按照流式凋亡试剂盒处理细胞。检测药物浓度分别为0、200、300nmol/L硼替佐米组细胞在硼替佐米作用24h的细胞凋亡情况。
4、Fluo-4/AM染色激光共聚焦显微技术观察
将多发性骨髓瘤细胞RPMl8226细胞培养于Petri皿中24小时后,用PBS液漂沈细胞2～3次,加入终浓度为5μmol/L的Fluo-4/AM应用液,在37℃下孵育细胞约30min。用PBS液洗脱细胞外未结合的荧光,再于37℃下保温约10min,置于激光扫描共聚焦显微镜下实时观察300nmol/L硼替佐米作用组细胞的[Ca2+]i的变化。
结果:
1.CCK-8法检测硼替佐米对骨髓瘤细胞的增殖抑制率
硼替佐米抑制多发性骨髓瘤细胞RPMI8226生长,RPMI8226细胞生长抑制率与药物浓度呈依赖关系。
2.AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞技术检测细胞凋亡率
流式细胞仪检测结果显示,终浓度为200nmol/L硼替佐米处理24小时后的多发性骨髓瘤细胞RPMl8226细胞凋亡率为(19.84±2.37)%,终浓度为300nmol/L硼替佐米处理24小时后的多发性骨髓瘤细胞RPMI8226细胞凋亡率为(31.65±1.64)%,与对照组两者间差异均有统计学意义(P＜0.05)。
3.Fluo-4/AM染色激光共聚焦显微技术观察
终浓度为300nmol/L的硼替佐米作用后多发性骨髓瘤细胞RPMI8226,与空白对照组相比钙离子荧光强度明显升高(P＜0.05),两者之间差异有统计学意义(P＜0.05)。
结论:
硼替佐米通过钙超载诱导骨髓瘤细胞凋亡,具有浓度依赖关系。其结果且与硼替佐米诱导神经细胞凋亡结果一致。由此推测钙超载可能参与周围神经病变的产尘。