食品中常见的致病菌是引起食物中毒的主要原因之一,可导致多种疾病发生,严重威胁着人们的健康。快速、准确的检测食品中的致病菌是有效预防和控制病原菌感染的前提条件。目前,食品检验检疫工作中的细菌鉴定大多仍然停留在简单的生化实验水平上,其操作烦琐,耗时长。少数用分子生物学的方法,如PCR、探针杂交等技术检测,存在假阳性率较高的缺点。本研究针对上述技术的缺点,运用通用芯片技术平台建立了快速、准确、高通量检测食源性致病菌的方法。 本研究首先通过生物信息学方法设计出独特的标签互补探针,并将其固定在经表面修饰的片基上,研发制作了通用芯片。然后针对八种食品中常见的致病菌:单核增生增生李氏菌、肠出血性大肠杆菌O157:H7、小肠结肠耶尔森氏菌、肠炎沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌、福氏志贺氏菌及A型产气荚膜菌,设计不同的引物对其进行特异性扩增。再通过通用芯片独特的液相、固相两次杂交技术,对这八种食源性致病菌进行检测。在研究过程中,对PCR产物的纯化方案、报告基团的引入方法及杂交条件等实验过程进行探索和优化。以上述八种菌为检测模型,对经过优化的通用芯片技术平台体系的灵敏度和特异性进行评估和鉴定。 通过试验,本研究获得了以下成果:(1)制作出背景低,杂交效率高的通用寡核苷酸芯片;(2)通过优化实验,确定了用SAP、Exo I和蛋白酶K联合使用对PCR产物进行纯化,可短时间、低成本、高效的获得PCR纯化产物;(3)通过用LDR技术引入报告基团,在杂交温度为60℃,杂交时间为1h的条件下,能够得到强而稳定的荧光信号;(4)通过杂交结果可以看出八种菌均可以在相应的探针位置处被检出,没有一种菌出现假阳性结果,各个菌之间也不存在交叉杂交的现象。八种菌的最低检出限分别是大肠杆菌O157:H7 1.2×10~2cfu/mL,单核细胞增生李氏菌8.5×10~2cfu/mL,肠炎沙门氏菌1.8×10~2cfu/mL,金黄色葡萄球菌6.2×10~2cfu/mL,蜡样芽胞杆菌5.7×10~2cfu/mL,产气荚膜菌9.3×10~2cfu/mL,福氏致贺菌1.7×10~2cfu/mL,小肠结肠耶尔森菌1.1×10~2cfu/mL。这些结果比各菌株相应的PCR检测灵敏度至少高出一个数量级。