论文部分内容阅读
目的:研究经方桂枝芍药知母汤对佐剂性关节炎(AA)大鼠的药效作用,并通过COX信号通路及相关蛋白表达的影响,探讨经方桂枝芍药知母汤对类风湿性关节炎治疗作用的分子生物学机制。材料与方法:采用雌性SPF级Wistar大鼠,随机分为正常组、模型组、布洛芬组、桂枝芍药知母汤高剂量组(GSZM高剂量组)、桂枝芍药知母汤中剂量组(GSZM中剂量组)、桂枝芍药知母低剂量组(GSZM低剂量组)。除正常组外,其余各组均通过足掌注射完全弗氏佐剂(CFA),建立AA大鼠模型,淘汰造模不成功者,保证每组8只大鼠。造模1周后给药治疗:各组给药均采用灌胃给药的方式,模型组给生理盐水,布洛芬组给布洛芬混悬液(63mg/kg),GSZM高、中、低剂量组给中药水煎剂(34.65、17.325、8.6625g/kg)。中药饮片常规煎煮,桂枝芍药知母汤剂量配比遵《仲景全书》剂量,并折合大鼠等效剂量,共给药3周。一般药效学研究观察各组大鼠一般状态及体重变化情况;肉眼观察对大鼠足肿胀程度的变化,计算足肿胀度变化;智能热板仪测量各组大鼠对热疼痛刺激反应时间,观察各组对热疼痛阈值的影响情况;酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测大鼠外周血、足跖软组织中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)、白介素10(IL-10)的浓度水平,观察各干预药物对外周和组织局部中促炎和抑炎细胞因子的影响。大鼠踝关节病理切片观察各组关节软骨病理损坏情况,并进行评分对照;数字化成像系统(DR)检测踝关节正位,观察各组大鼠关节影像学改变。ELISA法检测外周血、足跖软组织中干扰素γ(INF-γ)和白介素4(IL-4)水平,以INF-γ代表免疫系统中辅助性T淋巴细胞(Th)亚群Th1浓度,以IL-4代表Th2浓度,INF-γ/IL-4比值反映各组Th1/Th2漂移情况;反转录实时定量PCR(Rt-QPCR)法检测足跖中Th1、Th2特异性转录因子T-bet、Gata-3的m RNA表达,以T-bet代表Th1浓度,以Gata-3代表Th2浓度,T-bet/Gata-3比值反应Th1/Th2漂移情况。蛋白质免疫印迹(Western blot)法检测各组大鼠足跖软组织中COX-1、COX-2、可诱导的一氧化氮合酶(i NOS)、TNF-α的表达,蛋白印迹图像分析及对比,观察各组对COX同工酶及相关蛋白的表达的影响。免疫组织化学法(IHC)检测COX信号通路中COX-2及上位蛋白核因子κB(NF-κB)p65、下位蛋白血管内皮生长因子(VEGF)的表达情况,并通过病理图像分析系统对IHC结果进行对比分析,反映各治疗组对COX信号通路的影响。结果:1.一般药效学结果显示:造模后大鼠一般状态欠佳;双足掌及踝关节肿胀明显,足肿胀度显著增高;热疼痛刺激阈值显著减少;踝关节病理形态观察显示关节软骨炎症细胞浸润明显,可见滑膜血管翳形成及结缔组织增生,病理评分显著增高;影像学结果提示,踝关节及软组织肿胀明显,关节面毛糙,关节腔变窄。经治疗3周后,各治疗组各项指标与模型组相比均有不同程度的改善(P<0.05)。一般状态好转,足肿胀减轻;足肿胀度显著降低(P<0.05);热疼痛刺激阈值显著增高(P<0.05);ELISA检测结果显示模型组外周血及足跖软组织促炎细胞因子TNF-α、IL-1β浓度水平均显著增高(P<0.01),抑炎因子IL-10水平显著降低(P<0.01),给药后中西治疗组TNF-α、IL-1β浓度水平均较模型组显著降低(P<0.01),IL-10水平显著升高(P<0.01)。其中GSZM高、中剂量组除IL-10水平明显低于布洛芬组外(P<0.01),在抑制促炎因子水平上与布洛芬组疗效接近,GSZM低剂量组各指标与其余三组均有明显差异(P<0.01);病理切片可见中西药治疗组关节滑膜结构均有所改善,炎症浸润有所减轻,关节病理损伤评分显著降低(P<0.05),DR显示踝关节及周围肿胀减轻。各治疗组间比较,GSZM高、中剂量组药效较好,接近西药布洛芬组,GSZM低剂量组药效显著低于其余三个治疗组。2.Th漂移检测结果:模型组外周血及周围软组织中IL-4水平显著降低(P<0.01),INF-γ水平显著增高(P<0.01),INF-γ/IL-4比值显著增高(P<0.01);足跖软组织中T-bet表达显著增加(P<0.01),GATA-3表达显著降低(P<0.01),T-bet/Gata-3比值显著增高(P<0.01),提示Th1/Th2向Th1方向漂移。各治疗组均能显著降低INF-γ/IL-4和T-bet/Gata-3(P<0.01),提示有促进Th漂移恢复的作用。其中GSZM高、中剂量组对Th漂移的恢复作用与布洛芬组接近。3.COX同工酶及相关蛋白表达检测结果:模型组COX-2、i NOS、TNF-α表达显著增多(P<0.01),经治疗后布洛芬组、GSZM高、中剂量组COX-2、i NOS、TNF-α表达显著减少(P<0.01);布洛芬组与GSZM低剂量组COX-1表达显著低于其余各组(P<0.01)。4.COX信号通路蛋白表达检测:模型组NF-κBp65、COX-2、VEGF表达均显著增加(P<0.01),经治疗后中西药治疗组NF-κBp65、COX-2、VEGF表达均显著降低(P<0.01),其中GSZM中剂量组与布洛芬组无显著差异,GSZM高剂量组VEGF表达显著低于布洛芬组(P<0.01),GSZM低剂量组表达均显著高于布洛芬组(P<0.01)。结论:1.桂枝芍药知母汤对AA大鼠关节及软组织肿胀症状有较好的改善作用。2.桂枝芍药知母汤能显著降低AA大鼠外周血及足跖部促炎因子水平,升高抑炎因子水平,作用效果与剂量水平呈正相关。3.桂枝芍药知母汤能显著降低AA大鼠INF-γ/IL-4、T-bet/GATA-3比值,揭示其治疗作用机制可能与调整Th1/Th2向左漂移的状态有关。4.桂枝芍药知母汤能显著抑制COX-2表达,保持或轻度抑制COX-1表达,这可能是其对RA有确切的治疗效果而产生较少副作用的主要机制之一。5.桂枝芍药知母汤对AA大鼠治疗的药效机制可能与抑制COX信号通路中NF-κBp65、COX-2、VEGF表达密切相关。