论文部分内容阅读
Chemerin也称为他扎罗汀诱导基因2（TIG2）或视黄醇受体反应蛋白2（RARRES2）,是2007年新发现的具有趋化作用的脂肪因子。Chemerin及其受体趋化因子受体1（CMKLR-1）在多种组织中广泛分布,包括脂肪组织（高表达）,肝脏、胎盘和卵巢等组织。近期有研究显示,Chemerin及其受体不仅与肥胖和代谢综合症等多种疾病相关,对动物生殖功能也有重要的调控作用。卵巢颗粒细胞凋亡直接影响卵子发育和排卵,氧化应激是引起卵巢颗粒细胞凋亡的常见因素;ERK1/2作为细胞凋亡的经典信号通路,对卵巢颗粒细胞增殖与凋亡也具有重要的作用。但目前有关Chemerin及其受体CMKLR-1在氧化应激引起的卵巢颗粒细胞凋亡中的具体作用及机制尚不清楚。因此,本研究以奶牛卵巢颗粒细胞为材料,分析Chemerin及其受体对氧化应激所致牛卵巢颗粒细胞凋亡的作用,具体研究内容及结果如下:1、牛卵巢颗粒细胞分离培养。从卵巢卵泡液中分离牛卵巢颗粒细胞（卵泡直径大约2-6 mm）,并采用卵巢颗粒细胞特异性受体-促卵泡生长激素（FSHR）对分离的牛卵巢颗粒细胞进行鉴定。结果:牛卵巢颗粒细胞生长状态良好,FSHR鉴定阳性颗粒细胞>95%。2、Chemerin及其受体CMKLR-1在卵巢颗粒细胞中的表达研究。本试验用600 μmol/mL H202处理牛卵巢颗粒细胞2 h,采用RT-qPCR和Western Blot检测氧化应激状态下（以正常培养组为对照）,牛卵巢颗粒细胞内Chemerin及其受体CMKLR-1的表达。结果表明:Chemerin及其受体CMKLR-1在牛卵巢颗粒细胞中均有表达。氧化处理后细胞内Chemerin蛋白的表达极显著上调（P<0.01）,Chemerin及其受体CMKLR-1 mRNA的表达也极显著升高（P<0.01）。提示Chemerin轴参与了牛卵巢颗粒细胞氧化应激过程。3、Chemerin对氧化应激所致牛卵巢颗粒细胞凋亡的作用分析。在氧化应激状态下,用Chemerin重组蛋白处理牛卵巢颗粒细胞使Chemerin表达升高,结果显示卵巢颗粒细胞内活性氧（ROS）及丙二醛（MDA）含量显著升高（P<0.05）,而超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-px）的活性显著降低（P<0.05）。另外,与对照组相比,Chemerin高表达极显著增加了氧化应激诱导细胞凋亡率（P<0.01）;Bax和Cleaved-caspase-3蛋白水平明显升高,而Bcl-2的蛋白水平降低。同时,Caspase-3的mRNA及Bax/Bcl-2 mRNA的比率显著升高（P<0.05）。说明Chemerin可能通过调节Bax、Bcl-2及Caspase-3的表达进而启动了促细胞凋亡途径而影响牛卵巢颗粒细胞的凋亡。此外,通过转染siRNA-Chemerin沉默Chemerin基因,结果显示:ROS和MDA含量下降,而SOD和GSH-px极显著升高（P<0.01）。另外,Bax和Cleaved-caspase-3蛋白水平明显降低,而Bcl-2蛋白表达上升,Caspase-3的mRNA和Bax/Bcl-2 mRNA的比率下降。说明抑制Chemerin的表达即可挽救氧化应激诱导的卵巢颗粒细胞凋亡。进一步证实Chemerin促进了氧化应激诱导的牛卵巢颗粒细胞凋亡。4、Chemerin介导ERK1/2信号通路调节氧化应激诱导牛卵巢颗粒细胞凋亡的研究。用Chemerin重组蛋白处理氧化应激的牛卵巢颗粒细胞,同时,通过添加ERK1/2通路抑制剂U0126,检测细胞内ROS含量、凋亡关键基因和ERK1/2磷酸化水平的变化,并分析抑制ERK1/2信号通路后Chemerin对氧化应激所致牛卵巢颗粒细胞凋亡的作用。结果显示:氧化应激状态下,高表达Chemerin增加了细胞内ERK1/2的磷酸化水平;沉默Chemerin基因可显著降低细胞内ERK1/2磷酸化水平（P<0.05）。说明高表达的Chemerin可激活ERK1/2信号通路。抑制剂U0126抑制ERK1/2通路后,添加重组Chemerin蛋白或沉默Chemerin基因后细胞中ROS的含量显著降低（P<0.05）;促凋亡相关蛋白Bax和Cleaved-caspase-3显著下调P<0.05,抑凋亡相关蛋白Bcl-2表达显著上调（P<0.05）,且Caspase-3 mRNA和Bax/Bcl-2 mRNA的比率下降。此外,抑制ERK1/2磷酸化水平的牛卵巢颗粒细胞中Chemerin及其受体CMKLR-1的表达较氧化应激组显著降低（P<0.05）。说明沉默Chemerin基因抑制ERK1/2通路可挽救Chemerin和氧化应激所致的牛卵巢颗粒细胞的凋亡。结果表明:Chemerin至少部分是通过ERK1/2信号通路来调节氧化应激状态下牛卵巢颗粒细胞的凋亡过程。