何首乌为蓼科植物何首乌Polygonum multlflorum Thunb的干燥块根,是临床常用补益中药,传统不认为是有毒的中药。然而,近年来国内外有关何首乌及其制剂肝损伤不良反应的报道逐渐增多,英国、加拿大、澳大利亚、我国的药品监管部门相继出台何首乌及其制剂肝损伤警示和相关监管政策,引起国内外广泛关注。课题组前期临床调研发现何首乌肝损伤病例具有特异质肝损伤特征,结合免疫因素在药源性特异质肝损伤中的重要影响作用,本文首先提出免疫应激是何首乌特异质肝损伤的重要诱因,进一步采用免疫应激模型验证何首乌特异质肝损伤的客观性,并对免疫应激介导的何首乌特异质肝损伤相关细胞因子、物质成分、差异基因及生物标志物进行了筛查。主要研究内容和结果如下：1.基于药物流行病学调查的何首乌特异质肝损伤的客观性：根据文献报道、以及对国家药品不良反应监测中心、解放军302医院药物性肝损伤病例的回顾性分析,排除易混淆诊断肝病、排除联合应用具有肝毒性西药、排除伪品、重金属/农残/真菌毒素污染等因素,结合生药学鉴定最终确认的何首乌肝损伤总体发病率较低,未见剂量、用药时间与发生率的相关性,推测属于特异质肝损伤。课题组前期研究发现了何首乌肝损伤临床样本中IL-1、IL-6、TNF-α等细胞因子表达显著上调,提示免疫因素可能参与了何首乌肝损伤过程；进一步分析发现,白发病、湿疹、白癜风、骨关节病、银屑病、系统性红斑狼疮等与免疫相关的基础性疾病的患者服用何首乌出现肝损伤的几率相对较高,这些患者往往伴随IL-1、IL-6、IFN-γ等细胞因子轻度升高,提示具有这些基础疾病的患者体质可能属于免疫应激状态,结合免疫因素在药源性特异质肝损伤中的重要影响作用,综上提示免疫应激可能是何首乌导致特异质肝损伤的重要诱因之一。2.基于免疫应激动物模型的何首乌特异质肝损伤的客观性评价：针对免疫应激可能是何首乌特异质肝损伤诱因的认识,采用国际上广泛使用的免疫应激介导的特异质药物肝损伤动物模型,考察何首乌特异质肝损伤的客观性。结果表明,在正常大鼠上单次灌胃给药超大剂量生何首乌50%乙醇提取物(75.6 g生药/kg,相当于临床常用剂量12g的70倍)也未见明显肝损伤作用,与文献报道结果一致,表明何首乌对正常动物的肝毒性不强；而在内毒素(尾静脉注射LPS 2.8 mg/kg)制备的免疫应激大鼠模型上,何首乌醇提物单次灌胃给药在1.08～75.6 g生药/kg的范围内均出现显著的肝功能损伤(均P<0.05),肝脏组织切片可见明显病理学改变,且表现出一定的量-毒关系,最低中毒剂量相当于临床常用剂量12g/日,病理、毒理学特征与文献报道的药物特异质肝损伤结果相似。上述研究结果从实验证实了免疫应激介导的何首乌特异质肝损伤的客观真实性。3.免疫应激介导何首乌特异质肝损伤的相关细胞因子筛查：为了进一步探讨何首乌特异质肝损伤与肝脏免疫应激状态的关系,采用Luminex细胞因子检测芯片对大鼠肝组织与血浆中细胞因子进行筛查。结果表明,与正常大鼠比较,免疫应激模型大鼠肝组织中IL-1β、IL-6、TNF-α等13个炎性细胞因子、趋化因子有不同程度的表达上调(P<0.05),表明肝脏处于免疫应激状态,但其表达上调量尚未达到引起明显肝损伤的程度；与免疫应激模型大鼠比较,联合给予何首乌(1.08 g生药/kg)的大鼠肝组织中有8个炎性细胞因子和趋化因子(IL-1、IL-6、TNF-α等)表达显著上调(P<O.05),表明肝脏发生急性炎症,与前述观察到的急性肝损伤现象吻合。上述在免疫应激模型大鼠筛查到的何首乌特异质肝损伤的相关细胞因子,与前述临床调研发现的多个细胞因子相吻合,综合提示机体免疫应激状态可能是何首乌特异质肝损伤的重要诱因之一。4.基于免疫应激状态的何首乌特异质肝损伤相关物质研究：采用上述免疫应激介导的特异质肝损伤评价模型,平行比较了生何首乌总提物(50%乙醇提取物)与不同萃取部位(乙酸乙酯部位、氯仿部位和其它部位)的肝损伤作用。结果表明,与正常对照组比较,免疫应激模型组、正常大鼠灌胃总提物和不同萃取部位组均未见明显肝损伤(P>O.05)；与免疫应激模型组比较,可比剂量(1.08g生药/kg)的总提物和乙酸乙酯萃取部位均可导致免疫应激模型大鼠明显的肝损伤(P<O.05),且乙酸乙酯萃取部位与总提物导致的肝损伤程度相当,而氯仿萃取部位、其它部位单独给药或联合给药(氯仿萃取部位+其它部位)均未导致免疫应激模型大鼠明显的肝损伤(P>0.05),进一步将乙酸乙酯萃取部位加回氯仿萃取部位和其它部位(与总提物相当),肝损伤再次出现。上述结果综合提示,乙酸乙酯萃取部位可能是何首乌特异质肝损伤作用的主要成分部位。液质联用仪分析表明,何首乌乙酸乙酯萃取部位主要包括反式二苯乙烯苷、顺式二苯乙烯苷、二苯乙烯苷二聚物等成分,顺、反二苯乙烯苷在该部位所占比例最高,可能与何首乌特异质肝损伤相关。为此,在免疫应激模型大鼠上对比考察了顺、反二苯乙烯苷的毒性差异。结果表明,与正常对照组比较,免疫应激模型组、正常大鼠灌胃顺、反二苯乙烯苷组均未见明显肝损伤(P>0.05)；与免疫应激模型组比较,反式二苯乙烯苷无明显肝损伤作用(P>0.05),顺式二苯乙烯苷可导致免疫应激模型大鼠明显的肝损伤(P<0.05)。此外,在正常人肝细胞(L02)上,相同浓度(2mg/mL、1.33mg/mL、0.89 mg/mL、0.59 mg/mL、 0.395 mg/mL.0.263 mg/mL)下顺式二苯乙烯苷的细胞毒性大于反式二苯乙烯苷。上述结果综合提示,顺式二苯乙烯苷的毒性大于反式二苯乙烯苷。由于一般情况下顺式二苯乙烯苷在何首乌药材中含量很少，主要是由反式二苯乙烯苷在溶液中经光照转化而成,提示何首乌在进行泡酒或药液保存过程中应避光保存,避免或减少顺式二苯乙烯苷的生成,降低临床应用发生特异质肝损伤的风险。5.何首乌特异质肝损伤相关的基因和代谢标志物研究：针对顺、反二苯乙烯苷对免疫应激模型大鼠肝损伤差异,采用基因芯片和代谢组学方法对何首乌特异质肝损伤的相关差异基因和代谢标志物进行初步研究。针对上述灌胃给予顺、反二苯乙烯苷的免疫应激模型大鼠肝组织,利用基因芯片筛选差异表达基因。结果表明,与反式二苯乙烯苷组相比,顺式二苯乙烯苷组有57条基因表达量显著上调,126条基因显著下调；利用KEGG数据库对信号通路进行了分析,顺、反二苯乙烯苷间的差异表达基因富集到PPAR signaling pathway、TGF-beta signaling pathway和Tryptophan metabolism等14条生物学通路,其中PPAR-γ信号通路相关性最强(显著下调,P值为1.72E-06),PPAR-γ信号通路基因下调可解除其对LPS诱导的NF-κB靶基因的抑制作用,表明TLR4-NF-κB通路可能是顺式二苯乙烯苷导致特异质肝损伤的重要基因通路,该结果与上述免疫应激介导的细胞因子筛选结果一致,综合提示免疫应激可能是顺式二苯乙烯苷特异质肝损伤的重要机制。利用代谢组学方法筛选与何首乌中顺式二苯乙烯苷特异质肝损伤相关的代谢标志物。采用UHPLC-Q-TOF/MS测定顺、反二苯乙烯苷联合LPS后大鼠血清中的内源性代谢产物,研究与肝损伤密切相关的内源性代谢产物的变化特征。结果显示,顺式二苯乙烯苷联合LPS后大鼠血清与正常大鼠、LPS模型大鼠、反式二苯乙烯昔联合LPS后大鼠血清的代谢轮廓差异显著；筛选出顺式二苯乙烯苷特异质肝损伤引发代谢紊乱的Bovinocidin、Uridine、D-Ornithine等9个特征标志物。通过KEGG数据库通路分析,筛选出Pyrimidine metabolism、 D-Arginine and D-ornithine metabolism、Ascorbate and aldarate metabolism等5条代谢通路与特异质肝损伤表型一致,提示上述通路可能是顺式二苯乙烯苷导致特异质肝损伤的重要代谢通路。综上,本文从临床病例分析、整体动物实验水平论证了何首乌特异质肝损伤的客观真实性,初步证实免疫应激可能是何首乌特异质肝损伤的重要诱因之一,筛选发现了二苯乙烯苷构象变化与何首乌特异质肝损伤密切相关。本文研究结果对指导临床从免疫应激角度筛选何首乌肝损伤易感人群和生物标志物,阐明其毒性物质基础,探讨其生物学机制,针对性地建立科学防控方法和对策,避免易感人群用药引起的肝损害风险,解决何首乌肝损伤问题有重要参考价值。