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目的:研究肺炎链球菌H2O2是否导致肺泡上皮细胞线粒体损伤,进而引起mtDNA氧化损伤并释放到胞质;释放至胞质中的mtDNA能否进一步诱导肺泡上皮细胞I型IFN反应,从而影响宿主细胞免疫应答。背景:肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae,S.pn）作为人类鼻咽部重要的条件致病菌之一,可引起肺炎、中耳炎、脑膜炎及菌血症等。S.pn spxB基因编码丙酮酸氧化酶,它可将丙酮酸分解产生大量H2O2。在S.pn生长过程中缺乏spxB基因后产生H2O2显著降低。研究显示在肺炎球菌性脑膜炎中,S.pn H2O2可以诱导线粒体损伤,并最终介导细胞凋亡。而研究报道损伤的线粒体会释放大量的线粒体损伤相关分子模式（mtDAMPs）,包括mtDNA、ATP等,进而激活宿主免疫应答。但是S.pn H2O2引起肺泡上皮细胞损伤,激活宿主免疫反应的机制尚不完全清楚。我们推测S.pn H2O2有可能引起肺泡上皮细胞mtDNA氧化损伤并降低肺泡上皮细胞中mtDNA含量,导致mtDNA释放到细胞质中,诱导IFNβ的表达。方法:1、在体内实验中建立肺炎小鼠模型,分为PBS对照组、D39感染组、D39+Cat感染组以及D39ΔspxB感染组,通过ELISA及荧光定量PCR检测C57BL/6小鼠血清和肺组织中IFNβ的表达;在体外实验中,分为阴性对照组、D39感染组、D39+Cat感染组以及D39ΔspxB感染组,通过ELISA及荧光定量PCR检测A549细胞培养上清及细胞中IFN-I（IFNа、IFNβ）的表达。同时用不同浓度H2O2或1 mM H2O2刺激A549细胞不同时间点,ELISA及荧光定量PCR检测IFN-I的表达。Western Blot检测在不同感染条件下A549细胞中STING蛋白的表达。1 mM H2O2及S.pn H2O2刺激野生MEF细胞和sting缺陷的MEF细胞,荧光定量PCR检测Ifnβ的表达,进一步验证STING是否参与S.pn H2O2诱导IFN-I级联反应的过程。2、在体内实验中,通过肺组织HE染色、免疫组化检测肺组织PINK-1的表达以及Pgc1-a的减低来验证是否S.pn H2O2能造成C57BL/6小鼠肺组织病理损伤以及线粒体损伤;在体外实验中,分为阴性对照组、1 mM H2O2处理组、D39感染组、D39+Cat感染组以及D39ΔspxB感染组,通过检测A549细胞线粒体膜电位降低以及电镜观察A549细胞中线粒体超微结构的改变来验证S.pn H2O2是否导致A549细胞中线粒体损伤;通过免疫荧光检测DNA氧化损伤标志物8-OHdG与线粒体的共定位,证实mtDNA的氧化损伤情况;荧光定量PCR检测S.pn H2O2刺激后A549细胞中mtDNA含量的变化以及释放到胞质中mtDNA的表达水平。最后通过分离感染后胞质DNA,转染进A549细胞后,荧光定量PCR检测IFNβ的表达。同时,体外构建mtDNA缺陷的A549细胞,分别用H2O2处理以及D39感染不同时间点,荧光定量PCR检测IFNβ的表达,探究mtDNA是否在S.pn H2O2介导IFN-I过程中发挥关键作用。结果:1、体内肺炎小鼠模型中,D39感染组与D39ΔspxB感染组以及D39+Cat感染组相比,可诱导血清和肺组织匀浆中IFNβ表达上调;在体外S.pn感染A549细胞,与D39ΔspxB感染组以及D39+Cat感染组相比,D39感染组诱导A549的IFN-I级联反应;同时外源性H2O2刺激也可诱导A549细胞中IFN-I级联反应。2、体外实验中,与D39ΔspxB感染组以及D39+Cat感染组相比,D39感染组可诱导A549细胞STING蛋白表达上调。当细胞内mtDNA明显降低或敲低STING时,D39感染和H2O2刺激均不能诱导A549细胞IFN-I表达。3、体内实验中,与D39ΔspxB感染组以及D39+Cat感染组相比,D39感染组导致C57BL/6小鼠肺组织显著的组织病理损伤,PINK1累积以及Pgc1-a表达减少;体外实验中,与D39ΔspxB感染组以及D39+Cat感染组相比,D39感染组可引起A549细胞线粒体膜电位降低以及线粒体超微结构变化,包括线粒体肿胀,皱缩和嵴结构的破坏。4、与D39ΔspxB感染组以及D39+Cat感染组相比,D39感染组可引起A549细胞线粒体中8-OHdG表达上调,也可造成肺组织与A549细胞mtDNA拷贝数和转录水平明显降低,进一步导致mtDNA释放到细胞质中。而释放到胞质中的mtDNA可诱导A549细胞IFNβ表达上调。结论:本研究证实了S.pn分泌的H2O2能诱导肺泡上皮细胞线粒体损伤,及mtDNA氧化损伤并泄漏到细胞质中,进而激活STING信号通路,诱导宿主细胞IFN-I级联反应。本研究首次阐明了S.pn H2O2诱导肺泡上皮细胞的IFN-I应答机制,也证明mtDNA损伤释放在介导宿主免疫反应中发挥重要作用。这有助于我们进一步深入理解S.pn与宿主固有免疫细胞之间的相互作用,也为寻找防治肺炎链球菌病的新策略提供新的思路。