多发性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)是一种浆细胞恶性肿瘤,以骨髓中异常浆细胞恶性增殖、分泌单克隆免疫球蛋白、正常免疫球蛋白受到抑制以及溶骨病变为特征。发生率占血液系统肿瘤的10%,占所有肿瘤的1%,死亡率占所有肿瘤的2%。美国癌症学会统计表明,2009年美国MM的新发病例约为20,580,包括男性患者11,680例,女性患者8900例,死亡约10,580例,MM发病率仅次于非霍奇金淋巴瘤,成为血液系统的第二位常见的恶性肿瘤。在我国也呈逐年升高的趋势。MM的治疗主要包括传统化疗,造血干细胞移植以及新药治疗。目前,新的靶向治疗药物已经成为治疗MM的重要手段,但就目前而言,骨髓瘤仍是不可治愈的疾病。维甲酸在诱导分化治疗急性早幼粒细胞白血病领域取得的巨大成功,鼓舞人们进行深入研究肿瘤的分化治疗策略。但在诱导骨髓瘤细胞分化方面其作用机制尚未完全阐明。因此,需要对其分子生物学机制进一步研究,以便为临床新药的开发与使用提供理论依据,进而制定新的联合用药方案,提高临床疗效。内质网(endoplasmic reticulum, ER)是真核细胞中负责分泌性蛋白折叠和组装的细胞器。当细胞在病原感染、化学损伤、遗传突变、营养剥夺,以及正常分化(如B细胞分化)等各种内外源因素刺激下,ER中未折叠或错误折叠的蛋白增多,出现ER应激(ER stress),应激信号能通过ER膜传递到细胞核中,继而引起一系列特定的靶基因转录上调和蛋白质翻译水平下调,以使细胞能继续存活,这种反应就是未折叠蛋白反应(unfolded protein response, UPR)。MM细胞是浆细胞克隆增生性肿瘤,同正常浆细胞一样,骨髓瘤细胞具有高度发达和扩张的粗面ER,每秒钟能产生成千上万个免疫球蛋白分子,大量的免疫球蛋白在分泌之前必须经过ER的正确折叠和组装。如果这些蛋白不能被正确折叠,就会出现ER应激,诱导UPR的产生。浆细胞通过UPR减少免疫球蛋白分子的翻译,增加ER伴侣分子GRP78(glucose regulating protein 78)和GRP94(glucose regulating protein 94)以及折叠酶的表达,增强ER相关蛋白质降解途径(ER-associated degradation, ERAD)活性,提高细胞处理未折叠蛋白的能力,使之存活。目前研究显示ER膜上有3种跨膜蛋白感应ER应激：PERK(PKR-like ER kinase)、ATF6(activating transcription factor-6)以及具有激酶和核酸内切酶活性的IRE1(inositol-requiring enzyme 1)。活化后的IRE1具有核酸内切酶活性,对XBP-1 mRNA进行剪接形成376aa的XBP-1剪接蛋白(XBP-1s);未经剪接的XBP-1 mRNA则形成261aa的蛋白(XBP-1u)。XBP-1是具有b-zip结构的转录因子,大量证据表明XBP-1对B细胞分化成熟为浆细胞,并分泌免疫球蛋白是至关重要的,为浆细胞分化所必需。XBP-1-/-的B淋巴细胞胞浆中可以表达免疫球蛋白,但不能大量的分泌免疫球蛋白,也不能完成B淋巴细胞的最终分化过程；在XBP-1-/-的B淋巴细胞中经基因转染后重新表达XBP-1 mRNA,可以有效地恢复免疫球蛋白的分泌。因此,XBP-1在UPR时表达上调,是UPR的关键靶基因,也对浆细胞的成熟、分化具有重要意义。目前研究显示UPR在正常B细胞向浆细胞的分化过程中起重要的作用,没有UPR,浆细胞不能完成最终的分化和分泌免疫球蛋白。XBP-1在UPR活化时表达上调,并增加UPR靶基因伴侣分子GRP78和GRP94的表达,调节UPR。XBP-1也是UPR反应元件中与浆细胞分化相关的唯一转录因子。当前研究国际上对诱导分化治疗MM研究甚少,尤其通过修饰未折叠蛋白反应诱导MM分化还是空白。因此,我们设想通过UPR的经典诱导剂二硫苏糖醇(DTT)或衣霉素(tunicamycin)诱导MM细胞发生UPR,观察对MM细胞分化的影响,研究XBP-1u、XBP-1s以及下游的伴侣分子GRP78、GRP94等的表达,然后采用RNAi等技术,影响XBP-1u、XBP-1s等的表达修饰UPR,最终达到明确诱导MM细胞分化的机制。本实验研究包括以下三个部分：第一部分小剂量UPR诱导剂诱导骨髓瘤细胞分化的实验研究目的探讨小剂量UPR诱导剂对骨髓瘤细胞的分化作用。方法用小剂量UPR诱导剂(TM, DTT)处理MM细胞株U266, RPMI-8226。Annix V检测细胞的凋亡率。经细胞涂片,瑞氏染色后,显微镜下观察细胞形态；流式检测检测细胞表面CD49e的表达率；用人λ轻链ELISA试剂盒检测细胞培养上清液中轻链蛋白的浓度。结果UPR诱导剂TM 0.4μmol/L, DTT 0.5mmol/L处理骨髓瘤细胞株U266,RPMI-8226 72小时后,Annix V检测细胞的凋亡率均低于5%。细胞形态学观察与对照组相比即可见到细胞胞核缩小,胞浆丰富,核浆比例下降,核仁减少或消失,核染色质变粗、变密。有些细胞具有典型的碱性胞浆,胞浆丰富,出现胞核偏心,核染色质粗糙,凝聚成块状,着色深,排列成车轮状,,呈现成熟浆细胞特有的形态改变,有别于细胞凋亡的早期形态学改变。U266细胞CD49e的阳性率在对照组8.61±0.82%,TM处理72h后,U266细胞CD49e的阳性率为43.15±3.78%,有统计学差异(p<0.01),DTT处理72h后CD49e的阳性率为38.08±2.9%,有统计学差异(p<0.01)。RPMI-8226细胞CD49e的阳性率对照4.89±0.37%,TM处理72h后,CD49e的阳性率为25.54±2.67%,有统计学差异(p<0.05)；DTT处理72h后CD49e的阳性率为11.83±1.38%(p<0.05)。U266细胞的培养上清液中轻链蛋白的浓度,对照组456.25±19.07ng/ml, TM处理72h组,692.35±45.4ng/ml,有统计学差异(p<0.01),DTT处理72h后,轻链蛋白的浓度为614.42±22.67ng/ml,有统计学差异(p<0.05)。RPMI-8226细胞的培养上清液中轻链蛋白的浓度,对照组292.24±23.59ng/ml,TM处理72h组,407.16±18.09,有统计学差异(p<0.01),DTT处理72h后,轻链蛋白的浓度为478.35±15.37g／ml,有统计学差异(p<0.05)。在原代细胞经UPR诱导剂处理72小时后,也得到有类似的结果,细胞具有形态学分化的表现,CD49e细胞的阳性率增加,培养上清液中轻链蛋白的浓度增加。结论小剂量UPR诱导剂可以诱导骨髓瘤细胞株和原代细胞进一步的分化。第二部分UPR诱导剂诱导骨髓瘤细胞分化过程中相关基因表达情况的研究目的研究小剂量UPR诱导剂(TM, DTT)在诱导骨髓瘤细胞分化过程中,未折蛋白反应相关基因GRP78,GRP94的转录水平变化,与UPR和B细胞分化密切相关的XBP-1u, XBP-1s在转录和蛋白翻译水平的变化。方法小剂量UPR诱导剂(TM, DTT)处理骨髓瘤细胞株U266,RPMI-8226,荧光Realtime PCR检测基因GRP78, GRP94, XBP-1u,, XBP-1s的转录水平变化,Western Blot检测XBP-1u, XBP-1s蛋白翻译水平的变化。结果小剂量UPR诱导剂(TM, DTT)处理骨髓瘤细胞株U266,RPMI-8226后与对照组相比,荧光Realtime PCR检测基因GRP78, GRP94, XBP-1u,的转录水平是明显上调的,上调水平约1.5～3.12倍,而XBP-1s的转录水平是下降的。Western Blot检测XBP-1u的翻译水平是相对增加的,而XBP-1s的蛋白翻译水平下调。结论在骨髓瘤细胞的诱导分化过程中发生了未折叠蛋白反应,XBP-1u的转录和翻译水平是相对增加的。第三部分调控基因XBP-1u/XBP-1s表达对骨髓瘤细胞分化的影响目的研究基因XBP-1u/XBP-1s表达水平的差异对骨髓瘤细胞分化的影响。方法分别采用siRNA沉默XBP-1u的表达,构建过表达质粒转染骨髓瘤细胞过表达基因XBP-1u和XBP-1s后,通过形态学观察,流式检测细胞表面CD49e的表达率,和ELISA试剂盒检测培养上清中轻链蛋白的含量。结果采用siRNA沉默XBP-1u的表达后,骨髓瘤细胞的进一步分化被阻断；过表达XBP-1u可以促进骨髓瘤细胞的分化,表现为形态学上分化成熟表现,CD49e的阳性率增加,细胞上清液中轻链含量是增加的；而过表达XBP-1s则不能促进骨髓瘤细胞的分化。结论XBP-1的表达水平与骨髓瘤细胞的分化密切相关,其中XBP-1u的上调在其中起着重要作用。