论文部分内容阅读
L-谷氨酰胺(L-Glutamine，简称Gln)是由L-谷氨酸的γ-羧基酰胺化而来的一种条件必须氨基酸。它是一种极有发展前途的新药，在临床上主要用于治疗脑神经疾病及消化道溃疡。世界上生产谷氨酰胺的主要生产国是日本，韩国也有少量生产，均采用传统的发酵技术进行生产。1997年日本开始发酵生法生产，到20世纪90年代中期其发酵水平达到60g/L，韩国的发酵水平为50g/L。目前，我国的药用谷氨酰胺的生产刚刚起步，开始有厂家采用发酵法生产。本论文中，主要采用分子生物学技术对其谷氨酰胺合成酶进行克隆和表达，然后用基因组重排技术进行定向进化，以期能实现谷氨酰胺的高产，为其工业化生产奠定技术基础。
早于1997年，德国科学家Jakoby等人就对谷氨酸棒杆菌谷氨酰胺合成酶(Glutamine Synthetase，GS)进行基因测序，发表了其全长基因序列。根据这一序列，我们设计了特异性引物，经PCR扩增了其全长基因。然后克隆到谷氨酸棒杆菌的质粒载体。经测序，克隆序列与谷氨酸棒杆菌的GS基因的开放阅读框架一致，证实为所要表达的基因。在甘氨酸为3﹪，预培养时间为2.5，并且进行连续两次的冻结-解冻循环的条件下，将重组质粒转化进谷氨酸棒杆菌中。优化了诱导条件后，我们在发酵24h时加入终浓度为0.5mM的IPTG，检测了谷氨酰胺合成酶基因在谷氨酸棒杆菌中表达其酶活力的情况，发现菌株谷氨酰胺合成酶的活力提高264﹪。此菌株命名为C．glutamicum pEC-XK99E-GS。
其次，我们还运用最新的基因组重排技术(Genome shuffling)对菌株进行了定向进化。经亚硝基胍(NTG)和紫外线诱变后，选用谷氨酰胺的结构类似物磺胺胍(SG)以及硫酸铵((NH<,4>)<,2>SO<,4>)筛选出四株具有两重抗性标记的谷氨酰胺高产菌株(产量分别为31.34 g/L，30.28 g/L，30.62 g/L和31.81 g/L)。然后在青霉素G为0.6U，处理3h的条件下去除谷氨酸棒杆菌的细胞壁，运用原生质体融合技术使具有不同正突变的多个全基因组进行随机重组。经三轮的基因组重排，谷氨酰胺的产量达到47.35 g/L，提高48.85﹪，菌株命名为C glutamicumG-SHU3。最后，我们对所获菌株：C．glutamicum pEC-XK99E-GS和C glutamicumG-SHU3进行了5-L发酵罐的发酵实验。在采用搅拌速率为850 rpm，通气量为1.5 WM的条件下和初期脲量为1.5 g/L(摇瓶初脲量的30﹪)，在发酵中后期流加45﹪的尿素达到控制pH维持在6.2左右，同时达到补充氮源的双重目的。C．glutamicum pEC-XK99E-GS5-L发酵产量提高到63.00 g/L，发酵周期缩短为28h，产率为2.25 g．L<-1>/h。而C. glutamicum G-SHU3发酵产量提高到74.82g/L，发酵周期缩短为36h，产率为2.08 g．L<-1>/h。