肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS)是由汉坦病毒引起的急性传染性疾病,在世界范围内广泛流行,疫源地分布于5大洲70多个国家,已成为世界公共卫生问题。我国是世界上HFRS疫情最严重的国家,年报告发病人数约为4万-6万,占世界报告病例总数的90%以上。HFRS严重危害人民的生命健康安全,是我国重点防治的急性传染病之一。近些年来合并较多并发症的HFRS病例在临床上越来越多地出现,这些病例极易进展至多器官功能衰竭、颅内出血和弥散性血管内凝血,这些亦是该病导致死亡的主要原因,因此虽然近几年肾综合征出血热的年发病率有所下降,但针对该病的防控形势却越来越严峻。目前市场上还没有肾综合征出血热的特效治疗药物,临床上主要以对症治疗为主。研究表明抗汉坦病毒中和抗体可以快速有效地中和体内的汉坦病毒,达到治疗的目的,所以通过抗汉坦病毒中和抗体治疗肾综合征出血热,已经成为国内外临床医学和生物制药专家的共识。本实验尝试利用基于单细胞PCR技术的全人源单克隆抗体制备技术,进行抗汉坦病毒全人源中和抗体的研制。首先采集了4名肾综合征出血热患者的恢复期外周血共80m L,通过密度梯度沉降法,从这些外周血中分离出淋巴细胞。然后根据B细胞表面分子标记特征对分离的淋巴细胞进行荧光标记,通过流式细胞分选仪分选CD3-/CD20-/CD19+/C D27+/CD38+的单个浆细胞,共分选获得2200个B淋巴细胞。接下来分两步从单个B细胞中扩增抗体基因。由于单B细胞中的抗体基因序列是未知的,而抗体基因又具有丰富的亚型,因此第一步以覆盖绝大部分抗体可变区基因家族的18条引物进行RT-PCR,在一个反应体系中同时扩增单个B细胞中抗体的轻链可变区基因和重链可变区基因;第二步再以RT-PCR的产物做为模板,分三个反应体系进行巢式PCR,分别扩增H链、κ链以及λ链可变区基因,重链扩增VDJ重链基因区段,轻链扩增VJ轻链基因区段,混合引物包括针对每一个抗体可变区基因家族的特异引物。最终从2200个单个B淋巴细胞中获得了427个H链可变区基因片段、880个κ链可变区基因片段458个λ链可变区基因片段,阳性比例分别为20%、40%和21%,轻链中κ链和λ链的占比分别为66%和34%,基本符合人的表达κ链和λ链的B细胞的比例,其中轻重链基因天然配对且唯一的抗体基因是130对。获取抗体基因后需要进行抗体表达和筛选,但是传统构建表达载体转染哺乳动物细胞表达抗体的方式费时费力,为了加速初期筛选,我们尝试利用线性表达框表达130对抗体基因。构建线性表达框时将CMV启动子、抗体信号肽序列、抗体轻/重链的可变区基因序列、抗体轻/重链恒定区序列和poly A信号序列等转录翻译必需元件通过一步重叠延伸PCR构建成一个完整的线性片段,将轻/重链线性片段共转染HEK-293悬浮细胞,130个抗体中120个获得表达,与传统的克隆方法相比,通过线性表达框表达抗体,大大降低了工作量,在3-4天内便可获得可用于后续筛选的抗体。线性表达框表达抗体的水平多数可以达到1.2μg/m L以上,可以满足抗体特异性筛选的需要。随后以灭活的汉坦病毒作为抗原,通过ELISA对成功表达的抗体进行了特异性检测,结果显示,120个单抗中有51个可以特异性结合灭活的汉坦病毒,占42.5%。随后我们从这51个单抗中挑选30个特异性较高的单抗,将其轻重链构建到表达载体中,并瞬时转染到HEK-293悬浮细胞中进行表达纯化,30个都获得了表达,纯化后抗体浓度在0.5-1.2mg/m L之间。抗体中和活性检测我们采用的是荧光抗体病毒中和试验,通过FITC标记的抗汉坦病毒单抗检测病毒感染的细胞定量病毒,进而判断单抗的中和作用。通过检测我们筛选到2个具有中和活性的抗体(20C8、11H11),两者中和效果都存在剂量依赖关系,其中11H11中和作用明显强于20C8,0.16μg的11H11可以中和70%200 TCID50病毒,而中和同样的病毒需要0.64μg的20C8。以灭活的汉坦病毒作为抗原,采用ELISA方法初步测定抗体与抗原的结合力,20C8的结合EC50约为8.3×10-8 mol/L,11H11的结合EC50约为1.8×10-6 mol/L。汉坦病毒结构蛋白G1和G2蛋白是两个主要的中和抗原,预期以这两个蛋白作为抗原筛选特异性抗体,分别用HEK-293悬浮细胞和毕赤酵母表达这两个蛋白的膜外区,结果在毕赤酵母中G2蛋白有少量表达,而G1没有检测到表达产物;G1和G2在HEK-293悬浮细胞中都可以实现表达,但是G1和G2主要存在于细胞膜上,没有分泌到细胞外。汉坦病毒中和抗原G1/G2的表达一直是世界性难题,后续需要在现有工作基础上开展进一步研究,为确定20C8和11H11的抗原表位,并深入评价这两株抗体的亲和力和特异性奠定基础。利用本课题所建立的单B细胞全人源抗体制备技术,可以从传染病患者或者疫苗免疫者外周血出发制备预防或治疗性抗体,是研制突发传染病病原体中和抗体的有效手段;本研究筛选到的两个具有中和活性的抗汉坦病毒单抗,经过进一步的评价和优化,可能成为潜在的治疗HFRS的被动免疫制剂。