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腹泻的发病机制早已得到广泛讨论,但其确切机制仍需要深入研究。事实上,肠上皮细胞对大量细菌及其成分已产生耐受性,但是微生物产物是如何打破这种已建立的耐受并诱发腹泻和其它炎症发生的仍然不很清楚。肥大细胞位于宿主和外环境的表面如皮肤、呼吸道和肠道。肥大细胞被认为是宿主抵御细菌感染的关键物质。但是,微生物产物诱导肥大细胞介质释放从而导致腹泻的机理尚不清楚。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)是感染性腹泻的病因之一。肽聚糖(Peptidoglycan,PGN)是几乎所有G~+和G~-菌的细胞壁成分,具有很强的免疫活性,它能够改变免疫细胞的功能。并可能在细菌性腹泻中起关键作用。本研究的目的:1)PGN对T84细胞单层(人类肠上皮细胞系)屏障动能的影响;2)肥大细胞对T84屏障功能的影响;3)肥大细胞系对PGN吸收途径;4)口服PGN诱发小鼠腹泻模型的建立;5)TLR2(Toll-like receptor,TLR)和NODs(Hucleotide-binding oligomerization domain,NOD)在介导PGN诱发的肠道肥大细胞激活过程中的意义;6)肥大细胞激活在PGN诱导的腹泻中的必要性。实验方法1.细胞培养和T84细胞单层功能的检测本实验采用T84细胞单层(T84 Monolayer)细胞。为了评估T84细胞单层转运PGN,我们把来自金黄色葡萄球菌的纯化的PGN及HRP(Horseradishperoxidase,HRP)加入到细胞跨膜培养系统中。采用ELISA的方法检测样本中的PGN、HRP。HRP流量作为评价T84细胞单层的通透性指标。2.人肥大细胞系HMC-1、人单核细胞系THP-1、人中肾上皮细胞系HEK293吸收和转运PGN的检测T84细胞单层和HMC-1(THP-1、HEK293)共同培养于细胞跨膜培养系统中,然后加入PGN至肠腔侧中,2h后收集细胞。细胞蛋白提取后用Western-Blot的方法检测细胞中的PGN成分。一部分细胞用冷的丙酮固定后,用抗PGN单克隆抗体及荧光标记的兔抗鼠Ⅱ抗孵育,共聚焦显微镜观察。3.组织胺分析用ELISA试剂盒检测MHC-1(THP-1、HEK293)、小鼠结肠粘膜肥大细胞及P815细胞(小鼠肥大细胞系)5-HT(5-羟色胺)和组织胺水平。4.已敲除HMC-1细胞中TLR2和NOD2的表达RNAi技术用于检测已敲除HMC-1细胞中TLR2和NOD2的表达。siRNA转染的效果通过RT-PCR和Western-Blot的方法检测。5.PGN诱发的鼠类腹泻动物模型用纯化的PGN不同剂量溶于生理盐水中灌胃,灌胃前用肥大细胞对抗物预处理。计算每只小鼠粪便中含水的百分比。记录每只小鼠的小肠、大肠湿重及体重。小肠和大肠占体重的比率作为评估肠道液体的指标。6.P815细胞TLR2、NOD1的表达免疫细胞化学、Western-Blot方法观察P815细胞TLR2、NOD1的表达情况。7.免疫染色共聚焦显微镜观察造型小鼠肠粘膜肥大细胞及P815细胞TLR2、NOD(1 or 2)的表达。8.肥大细胞重建培养的肥大细胞(纯度＞95%)以30,000,40,000,和50,000个细胞/只的剂量通过尾静脉注射到肥大细胞缺如小鼠(W/Wv)体内1月后用于重复口服PGN实验。统计学处理采用SPSS10.0软件对数据进行统计分析。所有数据均以X±SD表示,组间差异用t检验检测,三组及三组以上的组间比较用方差分析,P＜0.05认为差异具有显著性。结果1.把PGN加入细胞跨膜培养系统的肠腔侧,把T84单层的TER(Transepithelialelectric resistance,TER)和T84对HRP的通透性作为检测屏障功能的指标。结果表明,只加PGN并不降低T84细胞单层的TER和通透性,与对照组相比没有明显差异。说明PGN并不直接破坏肠粘膜屏障。2.把融合的T84细胞和HMC-1共同培养在细胞跨膜培养系统中。在加入PGN到肠腔侧2h后,培养基中组织胺的释放量的增加呈剂量依赖性,电镜结果表明肥大细胞广泛脱颗粒。T84细胞单层的TER在PGN刺激后明显降低,并且在肥大细胞稳定剂预处理后明显得到抑制。由此证实T84细胞转运的PGN是通过激活HMC-1而完成的。3.为了证明TLR2介导PGN在肥大细胞中的吸收,把HMC-1培养在含有或不含有PGN的培养基中2h。然后收集并处理HMC-1细胞以证明TLR2表达。数据显示:TLR2在HMC-1细胞中的表达:0.28±0.06,在THP-1细胞中的表达:0.29±0.1,在HEK 293中没有表达。用抗TLR2抗体预处理的细胞上述过程受到抑制。Western-Blot、免疫细胞化学的方法同样证明TLR2参与肥大细胞吸收PGN。4.RT-PCR结果显示在MHC-1细胞中检测到NOD2 mRNA(0.28±0.08),THP-1:0.27±0.06,而在HEK293细胞中没有检测到NOD2 mRNA。经预处理的HMC-1细胞释放组织胺与对照组相比明显受到抑制。结果显示,PGN被吸收入细胞后与NOD2捆绑在一起从而激活MHC-1。5.用免疫细胞化学的方法在共聚焦显微镜下观察HMC-1,进一步检测PGN是否被吸收到MHC-1细胞内。结果表明,PGN被HMC-1和THP-1细胞吸收,并且呈剂量依赖性,PGN没有在HEK293细胞中检测到。6.HMC-1和T84细胞单层共同培养于细胞跨膜培养系统中。分别在肠腔侧中加PGN和不加PGN。在基底膜侧中加MHC-1和不加MHC-1。HRP流量及TER作为记录上皮屏障功能的指标。加入PGN组HRP的流量明显增加,TER明显降低,并呈剂量依赖性。用siRNA预处理TLR2和NOD2能抑制PGN致T84细胞单层屏障的破坏。HRP回收率的增加及TEP的降低与HMC-1的数量呈平行关系。证实被激活的肥大细胞危及T84细胞单层的屏障功能。7.PGN溶于生理盐水中以不同剂量给小鼠灌胃。腹泻的严重程度与PGN呈剂量依赖性。结果表明PGN能够诱导小鼠腹泻。用PGN处理肥大细胞缺如小鼠(W/Wv)和肥大细胞正常同系小鼠(+/+),结果+/+小鼠出现腹泻而W/Wv小鼠不出现腹泻。结果表明,肥大细胞在PGN诱导的腹泻中起重要作用。8.用电子显微镜检测肥大细胞脱颗粒,丢失颗粒成分或颗粒密度降低为脱颗粒表现。PGN处理的小鼠肠道组织肥大细胞脱颗粒现象非常明显。PGN处理的小鼠肥大细胞脱颗粒的比率明显增加,并呈剂量依赖性。用ELISA方法检测PGN含量,与对照组相比PGN组,5-HT和组织胺水平明显增高。用肥大细胞稳定剂酮替酚处理和抗体对抗TLR2和NOD1明显抑制5-HT和组织胺的释放及肥大细胞脱颗粒。9.为了证明PGN诱发肥大细胞激活的途径,我们采用免疫印迹方法评估PGN对细胞质I_ΚB水平的影响。I_ΚB水平的降低表明核因子I_ΚB释放及细胞核易位。用PGN处理P815细胞,Western Blot方法评估IκB-α,IκB-β磷酸化和非磷酸化表达,PGN能使IκB-α和IκB-β水平明显降低,并且用抗-TLR2抗体和抗-NOD1抗体预处理能抑制上述过程。表明IκB-α和IκB-β参与来自于已易位于细胞核的细胞质复合物的核因子IκB释放。10.小鼠经不同剂量肥大细胞稳定剂酮替酚预处理,然后PGN灌胃,腹泻被预处理的酮替酚抑制,并呈酮替芬剂量依赖性。PGN灌胃引起腹泻发生后,腹腔注射酮替酚仍能阻止腹泻的发生。抗组织胺和抗5-HT药物协同作用能减弱PGN诱发的腹泻。结论1.PGN不直接改变人肠上皮细胞系T84细胞单层及小鼠肠上皮屏障功能;2.PGN激活HMC-1细胞造成T84细胞单层屏障功能减退;3.TLR2和NOD2介导HMC-1细胞对PGN的吸收;4.TLR2和NOD1介导PGN诱发的小鼠肠道肥大细胞激活;5.口服PGN能够诱发小鼠腹泻的发生;6.肠上皮细胞经细胞内途径吸收PGN;7.肥大细胞稳定剂能够抑制PGN诱发的腹泻。