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纤维素是地球上最丰富的可再生自然生物资源。利用低成本的木质纤维原料来生产生物基产品以及生物能源，对于人类的可持续发展是非常重要的。减少纤维素酶的生产成本、改进纤维素酶性能和增加糖产量对于降低生物炼制的加工成本都是至关重要的。而改进纤维素酶的活力一般都是通过酶的定向进化来完成。酶的定向进化一般分为蛋白突变库的构建和蛋白突变库的筛选，而蛋白突变库的筛选是非常重要的一步，并且很难完成对大量突变体库的筛选。用作纤维素酶筛选的底物分为可溶性底物和不可溶性底物。因为纤维素酶对于可溶性底物与不可溶性底物的活性作用没有明确的关系，使用可溶性底物筛选出的纤维素酶主要可以改善酶的热稳定性，但是并不一定能够改善其对天然底物的水解能力，所以可溶性底物不能用作筛选或者选择出高活力的纤维素酶。然而纤维素酶表达在细胞内部，不可溶性底物不能通过细胞膜进入细胞内与其进行反应。因此，本实验采用细胞表面展示-释放系统，使用不可溶性底物作为定向进化中纤维素酶的筛选底物。本实验采用细胞表面展示-释放系统对源于Clostridium phytofermentans的内切纤维素酶CpCel5A进行了定向进化。对于大量突变库的构建，首先对CpCel5A进行了易错PCR，然后将PCR产物通过POE-PCR方法连接到细胞表面展示可控释放载体（pET20b-INP-In-5A）上来进行建库；而对于突变库的筛选，采用96孔板高通量培养以及透明圈法来对构建的纤维素酶突变库进行筛选。不同于传统的双酶切建库方法，本实验采用POE-PCR的方法建库，结果成功构建了一个2000多个突变体库。本实验利用细胞表面可控释放系统，采用不可溶性底物作为筛选底物，冰核蛋白（INP）将纤维素酶CpCel5A运输到细胞表面，通过蛋白内含子的剪切作用从细胞表面剪切，进而水解细胞外的不可溶底物-再生的无定形纤维素（RAC）。本实验采用透明圈实验进行突变库的筛选，通过验证以及BCA法测活，成功筛选出了一个高活力纤维素酶5D4，并将其成功构建到20b载体中进行表达，检测其对可溶性底物与不可溶性底物的活性差别。本研究利用细胞表面展示释放系统，采用不可溶性底物作为高通量筛选底物，成功筛选出了高活力突变体。因此，细胞表面可控释放系统可以用于纤维素酶的定向进化，在生物学领域的的研究中也将会有广阔的应用前景。