【摘 要】
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体细胞胚发生对于野生百合资源保存与种质创新具有重要意义。目前研究表明生长素对于体细胞胚发生具有重要调控作用,而生长素转运是外源生长素发挥功能的第一步,但生长素转运如何调控体细胞胚发生尚不清楚。本研究旨在筛选并挖掘细叶百合中生长素转运相关基因,并探究其在细叶体细胞胚发生过程中的调控功能,为阐明生长素调控百合体细胞胚发生的分子机理奠定基础。主要研究结果如下:1.为挖掘影响百合体细胞胚发生的关键因素,对
【基金项目】
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国家自然科学基金项目(31872150和31672179);
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体细胞胚发生对于野生百合资源保存与种质创新具有重要意义。目前研究表明生长素对于体细胞胚发生具有重要调控作用,而生长素转运是外源生长素发挥功能的第一步,但生长素转运如何调控体细胞胚发生尚不清楚。本研究旨在筛选并挖掘细叶百合中生长素转运相关基因,并探究其在细叶体细胞胚发生过程中的调控功能,为阐明生长素调控百合体细胞胚发生的分子机理奠定基础。主要研究结果如下:1.为挖掘影响百合体细胞胚发生的关键因素,对细叶百合体细胞胚诱导过程中外源毒莠定(picloram,PIC)浓度、PIC处理时间、光照条件、培养基p H值和培养基营养成分等进行了探讨。结果表明:适宜的PIC浓度和酸性培养条件是百合体细胞胚发生的关键因素,酸性培养条件可能通过影响PIC的存在形式进而调节PIC的转运过程;光照条件和培养基中的营养元素能够促进体细胞胚发生;缩短PIC处理时间和光照条件会促进体细胞胚萌发;在光培养(16/8 h)条件下,细叶百合鳞片在添加1.0 mg/L PIC、p H 5.8的MS培养基中处理3 d后转移到无激素的MS培养基中即可诱导体细胞胚发生,且诱导率高达80.0%。2.利用SMART测序技术成功构建了细叶百合体细胞胚全长转录组文库,结合课题组前期获得的二代转录组数据的纠错与校正,获得119,649条转录本,N50为3406,转录本最大长度达到了13,678 bp,平均长度为2,017 bp,其中110,888条(92.68%)转录本被成功注释。这些被注释的转录本在KEGG代谢通路中主要参与碳水化合物代谢(6,072条,5.07%)和信号转导(5,396条,4.51%),在GO分类中主要参与代谢过程(35,123条,29.36%)和催化活性(33,163条,27.72%)。3.对细叶百合中生长素转运相关基因家族成员进行了克隆与鉴定,并构建了生长素转运相关基因在体细胞胚发生过程中的表达谱。通过保守结构域比对和功能注释分析共获得63个ABCs、11个PIN/PILSs和3个AUX1/LAXs家族成员,其中7个ABCBs、5个PIN/PILSs和2个AUX1/LAXs成员参与生长素转运过程。对14个生长素转运相关基因在体细胞胚发生过程中的表达模式分析发现,除了Lp ABCB2以外,所有生长素转运相关基因都呈现出不同程度上调表达,其中Lp ABCB21和Lp PILS7的表达差异最显著,而且Lp ABCB21和Lp PILS7在整个体细胞胚发生过程中显著差异表达,通过表达趋势分析发现Lp ABCB21和Lp PILS7具有促进体细胞胚形成和发育的作用。4.优化了本团队创建的细叶百合高效遗传转化技术体系。结果表明:降低重悬液和共培养培养基的p H为5.0,并增加萌发培养基的氯化钙浓度为1.32 g/L时,获得的阳性植株数量提高了3—6倍,使农杆菌介导的百合稳定遗传转化效率在本团队之前建立的百合高效遗传转化技术体系的基础上提高了5.7—13.0%,最高可达46.3%。5.构建了Lp ABCB21和Lp PILS7过表达载体和CRISPR/Cas9敲除载体,通过转基因技术,获得Lp ABCB21过表达株系3株和突变株系7株,Lp PILS7过表达株系7株和突变株系6株。通过转基因株系的体细胞胚诱导结果以及组织形态学观察,初步证实了Lp ABCB21调控体细胞胚的早期形成,但表达量过高会抑制体细胞胚诱导效率,还能够调节体细胞胚以外起源方式发生;Lp PILS7主要调控体细胞胚诱导效率,并调节体细胞胚以内起源方式发生。本研究明确了细叶百合体细胞胚发生的关键影响因素,鉴定了细叶百合体细胞胚中的生长素转运相关基因家族成员,并通过过表达和CRISPR/Cas9基因编辑技术初步验证了Lp ABCB21和Lp PILS7在细叶百合体细胞胚发生过程中的调控作用。本研究为阐明生长素转运介导百合体细胞胚发生的分子机制奠定了基础,为百合基因功能研究提供了基因参考文库和技术手段。
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