体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer,IVF-ET)周期中易发生胚胎染色体非整倍体(aneuploidy)异常。表现为在正常二倍体基础上，染色体数目增加或减少一条甚至多条，最常见的类型为染色体三体型，在高育龄妇女中尤其突出。染色体非整倍体的形成机制一直是医学遗传学研究领域的重要课题，目前认为多数是细胞分裂时期染色体不分离、减数分裂时期染色单体提早分离和染色体丢失引起。染色体非整倍体胚胎由于等位基因间平衡失调，某一等位基因产物减半或增倍，可导致胚胎停止发育、自发流产、死产等而造成妊娠失败，是胚胎移植后着床率降低、流产率升高的重要原因。因此筛查胚胎染色体非整倍体情况，判断其利用价值尤为重要。目前在IVF-ET过程中，国内外许多学者在受精后16～18h常规观察胚胎原核数目并进行评分，以观察到2个明显原核(pronucleus，PN)或极体作为正常受精的判断标准选择适宜胚胎移植，以未见原核(0PN)、仅见单个原核(1PN)或多个原核作为异常受精的判断标准而将相应胚胎废弃。在临床实践中发现，IVF-ET周期的临床妊娠率偏低，仅为30％～40％左右。已有学者研究发现低妊娠率可能与2PN胚胎的染色体非整倍体异常有关。多数学者认为，异常受精胚胎多存在染色体非整倍体异常，不具有移植价值。而有研究证实，部分异常受精胚胎特别是1PN胚胎可见染色体二倍体，提示为正常受精。有学者认为，在没有正常受精胚胎可供移植的情况下，可选择此类胚胎移植，目前已有移植1PN胚胎出生正常新生儿的报道。多数中心选择D1受精原核为2PN的胚胎移植，而在无2PN胚胎时，是否选择0PN、1PN等异常受精胚胎移植尚存争议。体外受精胚胎的原核数目观察不能准确的反应胚胎的染色体非整倍体情况，影响了对胚胎移植价值的判断。目前，国内外学者多采用荧光原位杂交法(fluorescent in situ hybridization，FISH)研究体外受精胚胎的13、18、21、X、Y等染色体的单体、三体、等染色体非整倍体分布情况。研究焦点主要集中在高龄妇女、反复流产夫妇的体外受精胚胎的染色体非整倍体异常、多精受精胚胎形成的影响因素和染色体非整倍体异常分布等方面。尽管国内有少数学者研究了单原核胚胎的非整倍体发生情况，但对是否选择其进行移植尚无定论。0PN晚期卵裂胚胎的染色体非整倍体情况及移植价值研究，以及系统判断受精方式、年龄、获卵数、诱导排卵和超促排卵方案等影响因素对体外受精胚胎染色体非整倍体异常形成的影响国内尚未见报道。本研究旨在运用FISH技术检测体外受精胚胎染色体的非整倍体分布并判断其移植价值，为临床在无2PN正常受精胚胎移植的情况下，是否选择0PN、1PN胚胎移植提供理论依据。目的本研究拟通过FISH技术分析IVF-ET周期中胚胎的21号染色体的非整倍体情况，探讨染色体非整倍体高发的影响因素及临床利用价值，为临床在无正常受精胚胎移植的情况下，是否选择0PN、1PN胚胎移植提供理论依据。方法研究对象均选自2006年4月～2007年1月郑州大学第一附属医院生殖医学中心经IVF、卵胞浆内单精子显微注射(introcytoplasmic sperm injection,ICSI)技术治疗患者的D3废弃胚胎。用于研究的胚胎均经患者知情同意。收集废弃胚胎，按受精方式分为IVF、ICSI组；根据D1天观察的受精原核数目分为0PN、1PN、2PN、多PN组；按年龄分为＜30岁、30～34岁、≥35岁组；按获卵数分为＜17枚、≥17枚组；按超排方案分为人工授精(intrauterine insemination，IUI)改IVF方案组、GnRH-a短方案组、GnRH-a长方案组。各组废弃胚胎均采用透明带OCTAX-Laser Shot激光打孔、吸拉法活检卵裂球，进而Tween-20/HCl+甲醇/冰醋酸法裂解固定卵裂球，固定后用21号染色体特异位点探针(locus specific identifier,LSI)杂交行FISH，分析各组胚胎染色体非整倍体分布并比较差异。所有数据采用SPSS13.0统计软件包进行统计分析，组间的差异采用独立样本的t检验，率的比较采用x~2检验。检验标准取α=0.05，以P＜0.05为差异显着性判定标准。结果1、胚胎活检IVF和ICSI周期中活检292只废弃胚胎，共获得289个卵裂球，其中细胞完整、核清楚的卵裂球277只，活检成功率95.8％。2、卵裂球固定和杂交情况277只卵裂球细胞固定了250个，235个可见荧光信号，固定率为90.0％，出信号率为94.0％。3、卵裂球FISH结果3．1 IVF周期胚胎染色体的非整倍体结果IVF-ET周期中，0PN组和1PN组的胚胎染色体二体率分别为53.3％、58.1％，无显著差异(P＞0.05)，但均小于2PN组的73.1％(P＜0.05)。染色体多体率在≥3PN组为81.9％，显著高于0PN组的20.0％、1PN组的19.4％、2PN组的11.5％(P＜0.05)；≥3PN组的染色体二体率为9.1％，显著低于0PN组的53.3％、1PN组的58.1％、2PN组的73.1％(P＜0.05)。0PN组和1PN组的胚胎染色体异常率分别为46.7％、41.9％，显著高于2PN组的26.9％(P＜0.05)，但均低于≥3PN组的90.9％(P＜0.05)。3．2 ICSI周期胚胎染色体的非整倍体结果ICSI周期的胚胎中，0PN组和1PN组的胚胎染色体二体率分别为45.2％、31.0％，无显著差异(P＞0.05)。而2PN组胚胎染色体二体率为70.9％，显著高于其余各组(P＜0.05)。≥3PN组中，染色体二体率为29.0％，显著低于2PN组(P＜0.05)，多体发生率为67.8％，显著高于其余三组(P＜0.05)。0PN组和1PN组的胚胎染色体异常率分别为55.8％、69.0％，显著高于2PN组的29.1％(P＜0.05)。3．3受精方式与染色体异常IVF周期胚胎中，1PN组的染色体非整倍体率为41.9％，显著低于ICSI组的69.0％(P＜0.05)，≥3PN组染色体异常率为90.9％，显著高于ICSI组的71.0％(P＜0.05)。0PN组、2PN组染色体异常率无显著差异(P＞0.05)。3．4年龄与染色体异常与＜30岁组的27.9％、15.4％、8.3％、37.5％相比，≥35岁组中0PN、1PN、2PN、≥3PN组胚胎染色体异常率分别为66.7％、64.5％、47.1％、90.3％，显著增高(P＜0.05)；与＜30岁组相比，30～34岁组中0PN、1PN、≥3PN组胚胎的染色体异常率分别为59.0％、86.8％、84.0％，也显著增高(P＜0.05)，而2PN组胚胎的染色体异常率为23.8％，无显著差异(P＞0.05)。≥35岁组与30～34岁组相比，各组胚胎染色体异常率无显著差异(P＞0.05)。3．5获卵数与染色体异常获卵数≥17枚组的0PN、1PN、2PN、≥3PN胚胎的染色体异常率分别为55.9％、63.3％、20.7％、80.0％，与＜17枚组的48.1％、45.2％、38.1％、82.4％相比，无显著差异(P＞0.05)。3．6不同排卵方案与染色体异常IUI改IVF方案组中的0PN、1PN、2PN、≥3PN组胚胎染色体异常率分别为23.1％、25.0％、7.1％、35.7％，与GnRH-a短方案组的70.8％、75.0％、31.3％、96.2％比较，显著偏低(P＜0.05)；其中1PN、2PN、≥3PN组胚胎染色体异常率与GnRH-a长方案组的58.3％、40.0％、91.7％比较，显著降低(P＜0.05)，0PN胚胎染色体异常率与GnRH-a长方案组的70.8％相比无显著差异(P＞0.05)。GnRH-a短方案组与GnRH-a长方案组相比，两组胚胎染色体异常率无显著差异(P＞0.05)。结论1．0PN胚胎和IVF周期中的1PN胚胎染色体二体率为45.2％～58.1％，提示为正常受精，具有一定的移植价值。在无2PN正常受精胚胎移植的情况下，可选择0PN胚胎和IVF周期中的1PN胚胎移植，但建议结合胚胎植入前遗传学诊断以及产前诊断技术行染色体异常筛查。ICSI周期中1PN胚胎染色体异常率高达69.0％，不具有移植价值。2．2PN胚胎二体率为70.9％～73.1％，为胚胎移植的首选对象。2PN卵裂胚胎存在约8.3％～11.5％的染色体异常，可能是导致体外受精成功率低下的重要因素之一。3．3PN卵裂胚胎多体率为67.8％～81.9％，提示染色体非整倍体高发，不具有移植价值。4．年龄增高，特别是≥35岁；超排卵方案中Gn用量增加，可能增加体外受精胚胎的染色体异常的形成率。5．IVF周期中的1PN胚胎的染色体异常率高于ICSI组，≥3PN胚胎染色体异常率低于ICSI组，提示受精方式可能影响体外受精胚胎的染色体异常的形成。而取卵数目的多少可能对胚胎染色体异常的形成没有影响。