MSN是TGF-β超家族成员,其主要功能为抑制肌肉的生长。迄今为止,绝大多数围绕MSN的研究都集中在它调控肌肉生长和发育的方向。MSN在骨骼肌中高表达,成熟后分泌进入血液,通过循环系统可以遍布全身;另外,MSN的受体在组织中广谱表达。因此,MSN很有可能参与调控肌肉体系之外的其它生物学事件。P6C细胞是从结肠癌病人肿瘤组织中提取的具有干细胞特性的细胞。它有很强的自我复制和形成肿瘤的能力,而且有很强的耐受肿瘤药物的能力。现在医学虽然发展迅速,但对癌症仍没有很有效的治疗办法。肿瘤干细胞是肿瘤存在和转移的关键,所以治疗肿瘤干细胞是治疗肿瘤的症结所在,我们的实验发现MSN能引起结肠癌干细胞的凋亡,这为抗肿瘤研究提供了一种新的策略,对肿瘤的治疗有很重要的意义。目的肿瘤干细胞是近几年来提出的新的观点,肿瘤干细胞的提出也为肿瘤的治疗提供了新的策略。我们用流式细胞仪,激光共聚焦显微镜,western等技术探讨了MSN引起P6C细胞的凋亡及其机制。方法1.细胞培养。P6C细胞按常规方法培养于DMEM培养液中,培养液中另外添加10%胎牛血清和青霉素及链霉素各1%,置于37℃、5% CO2培养箱(SANYO)。2.流式细胞仪检测。Annexin V和PI检测细胞的凋亡情况,所用激发波长为488 nm,标记在Annexin V上的FITC经激发后发绿色荧光(530±30 nm),而结合于DNA的PI的发射波长是630±22 nm,为红色荧光。用这种方法可以区分活细胞(Annexin V和PI双阴性)、凋亡早期细胞(Annexin V阳性、PI阴性)、凋亡晚期和坏死细胞(Annexin V和PI双阳性)。3.Westernblot。收获细胞,PBS洗涤2次,每106细胞加入100μL裂解液,轻轻混匀,冰浴裂解30- 45分钟,离心,Bradford蛋白定量,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白质,再将蛋白质转移至硝酸纤维素膜上;上一抗4 oC过夜,PBST洗涤三次,再与辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗室温振荡孵育2小时,最后再用PBST洗涤三次,经ECL系统(Pierce)显色。4.免疫荧光。将细胞接种到6孔板内的小薄片上,按实验要求分成实验组和对照组,用3.7%的多聚甲醛固定细胞,37 oC,15-20分钟,1×PBS洗两次,然后用0.2%的Triton X-100在冰上打孔10分钟,用含有1%-5 %的FBS的1×PBS稀释一抗,加适量的一抗室温孵育1小时。1×PBS洗细胞,加适量的标记FITC或TRITC/cy3b标记的二抗,室温孵育细胞,在暗盒内为1小时,PBS洗细胞,封片剂固定玻片,荧光显微镜观察拍照。5.线粒体的提取。低渗处理细胞,Dounce微量匀浆器温和匀浆细胞收集匀浆液,差速离心法收集线粒体。Bradford方法定量各组分的蛋白浓度,进行SDS-PAGE和Western Blotting检测。6.细胞转染。六孔板,待细胞长至70%-80%贴壁时,开始转染,根据不同的细胞选择适合的转染方法。7.RNAI引物合成与测定。8.MTT法检测细胞的增殖情况。数1000-5000个细胞接种于96孔板,分别在6小时,12小时,24小时,36小时,MTT处理4小时,加DMSO溶解10分钟,酶标仪检测细胞的增殖情况。结果1.流式细胞仪分析检测发现凋亡的细胞比例随MSN剂量和时间的增加而上升。用Caspase的荧光底物标记被激活的Caspase,然后用流式细胞仪分析,结果显示MSN处理后Caspase被激活,western结果表明Caspase3, Caspase9前体明显减少。2.细胞克隆形成实验显示24小时,36小时的细胞克隆形成能力明显降低。3.MTT实验检测的细胞增殖能力结果显示24小时,36小时的细胞增殖能力是明显下降的。4.提线粒体做western检测到MSN处理后,细胞色素C在线粒体的表达量降低,胞浆中的表达量升高,说明细胞色素C由线粒体释放到胞浆。免疫荧光也可以明显的看出对照组的红色线粒体和绿色细胞色素C能很好的重合在一起,而加MSN处理组的红色线粒体和绿色细胞色素C不能很好的重合,这一结果和western的结果一致。5.我们Western检测了和凋亡相关的蛋白,发现bax,bcl-xl和VDAC是上调的。并且共聚焦显微镜检测到,对照组标记线粒体的红色荧光和标记bax的绿色荧光没有重合,而加MSN处理后红色和绿色有部分重合。这一结果说明加MSN处理后bax由胞浆部分转移到线粒体。IP的方法用发生构象变化的bax抗体在加MSN处理的细胞中检测到检测到bax而未处理组没有检测到,这一结果表明MSN处理后bax发生构象变化。6.敲减bcl-xl,发现bcl-xl敲减的细胞加MSN后细胞凋亡数减少,且western检测到bax的表达量下降。结论1. MSN能够引起肿瘤干细胞P6C细胞的凋亡。2. MSN抑制P6C细胞的克隆形成能力和细胞的增殖能力。3. MSN能够引起细胞色素C释放。4.凋亡相关蛋白bax,bcl-xl,VDAC上调。5.免疫荧光和westernblot检测bax发生构象变化,并且发生转位。6. bcl-xl敲减的细胞延迟MSN引起的P6C细胞凋亡,并且降低bax的表达。