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随着农药使用量的逐步增加,导致环境污染也日趋加重,威胁着人类的健康。作者以高效氯氰菊酯为研究对象,研究其对鱼的生物化学影响,并克隆了由高效氯氰菊酯诱导的调控Ⅱ相解毒酶基因和抗氧化蛋白基因表达的转录因子SiNrf2。此项研究对于降解环境中的农药以及有毒化合物,保护人类赖以生存的环境,具有重要的理论意义和实际价值。
高效氯氰菊酯对鱼的生物化学影响研究包括其对鲇鱼、鲤鱼代谢酶、RNA和蛋白质的影响研究。通过高效氯氰菊酯对鲇鱼急性毒性研究,确定高效氯氰菊酯对鲇鱼的安全浓度为0.356μg/L。采用高效氯氰菊酯的安全浓度处理鲇鱼和鲤鱼,鲇鱼和鲤鱼的6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G-6-PDH)和乳酸脱氢酶(LDH)活性以及RNA和蛋白质含量逐渐降低。撤离高效氯氰菊酯后,鲇鱼和鲤鱼的脑、腮、肝、骨骼肌肉中G-6-PDH和LDH酶活性、RNA和蛋白质含量恢复到对照水平。研究结果表明高效氯氰菊酯对鱼代谢酶,RNA和蛋白质的生物化学影响显著,撤离高效氯氰菊酯后能够逆转其对鱼的生物化学影响,G-6-PDH和LDH活性与蛋白质含量呈正相关关系。高效氯氰菊酯能破坏鱼的细胞新陈代谢。
分离获得高效氯氰菊酯诱导的鲇鱼幼苗mRNA,构建cDNA文库。用小鼠基因作探针,通过与鲇鱼的cDNA文库进行原位杂交,克隆了鲇鱼的Nrf2基因,命名为SiNrf2,其核苷酸长度为1761bp,编码587个氨基酸组成的蛋白质,与斑马鱼、小鼠、猩猩、青蛙Nrf2基因的氨基酸序列比较,同源性较高。转录因子SiNrf2具有6个功能Neh结构域,Neh1、Neh2、Neh3、Neh4、Neh5、Neh6。其中SiNrf2基因的Neh2结构域与CNC家族成员Nrf1、小鼠Nrf2、CncC和SKN-1的Neh2结构域同源性比较,Neh2的N端是高度保守的。SiNrf2基因的Neh4和Neh5结构域与小鼠Nrf2、p45和Nrf1的Neh4和Neh5结构域同源性比较,SiNrf2与p45和Nrf1的Neh5结构域有高的同源性,与p45和Nrf1的Neh4结构域没有任何同源性。转录因子SiNrf2与ARE顺式作用元件特异性结合,诱导Ⅱ相解毒酶和抗氧化胁迫蛋白基因的表达,Ⅱ相解毒酶基因包括苯醌氧化还原酶,谷胱甘肽-S-转移酶和UDP-葡萄糖醛酸基转移酶等,对农药的代谢具有重要的解毒功能。通过RT-PCR对SiNrf2基因的mRNA累积的研究,结果表明SiNrf2基因在肝、肾中表达量较高,本论文结果对深入研究环境中异源有毒物质的作用机制具有重要的意义。