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背景弥漫性肺泡出血(diffuse alveolar hemorrhage,DAH)是系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)的罕见且致命的并发症。由于DAH发病机制的复杂性,目前临床上针对DAH的治疗效果不佳,使得DAH的死亡率仍然高达90%。因此,探寻安全有效的DAH治疗方法是目前急需解决的问题。促红细胞生成素(Erythropoietin,EPO)是一种糖蛋白激素,临床上主要用于治疗贫血。随着对EPO功能的不断探索,越来越多的研究表明其具有多重生物学功能。在脑缺血再灌注损伤、急性肾损伤和术后认知功能障碍模型中,EPO发挥了免疫调节、凋亡抑制和器官保护作用。研究表明EPO通过与巨噬细胞上的EPOR结合调节其生物学活性,且巨噬细胞在DAH的发病过程中起重要作用。然而,却少有研究关注EPO在DAH中的治疗作用。本研究通过使用Pristane诱导的DAH小鼠模型评估了 EPO对DAH的治疗效果,并通过动物模型和体外实验探究了 EPO治疗DAH的作用机制。目的采用腹腔注射Pristane诱导DAH小鼠模型,探究EPO在DAH小鼠模型中的治疗效果及其作用机制。方法1、EPO对DAH小鼠治疗的效果。(1)EPO全程治疗对DAH小鼠治疗效果的研究。将30只雌性C57BL/6小鼠随机分为对照组、DAH模型组和EPO治疗组各10只。实验开始当天,DAH模型组和EPO治疗组小鼠一次性腹腔注射Pristane(0.5 mL),EPO治疗组第1天到第14天腹腔注射EPO(5 000U/kg),每天1次。在第14天解剖小鼠,肉眼观察肺组织出血情况,组织病理分析肺组织病理变化。(2)不同EPO治疗方案对小鼠DAH发生率的影响。将40只雌性C57BL/6小鼠随机分为DAH模型组、D1-3组、D7-14组和D1-14组各10只,实验开始当天,4组小鼠一次性腹腔注射Pristane(0.5 mL)。D1-3组从第1天到第3天腹腔注射EPO(5 000U/kg),每天1次,D7-14组从第7天到第14天腹腔注射EPO(5 000U/kg),每天1次;D1-14组从第1天到第14天腹腔注射EPO(5000U/kg),每天1次;模型组每天腹腔注射等体积PBS。在第14天解剖小鼠,肉眼观察肺组织出血情况,组织病理分析肺组织病理变化;(3)EPO全程治疗对DAH小鼠死亡率的影响。将40只雌性C57BL/6小鼠随机分为EPO治疗组和DAH模型组各20只:一次性腹腔注射Pristane 0.5mL制备DAH模型,EPO治疗组实验开始当天,一次性腹腔注射Pristane 0.5mL制备DAH模型,EPO治疗组从第1天到第14天腹腔注射EPO(5 000U/kg),每天1次;DAH模型组每天腹腔注射等体积PBS。观察30天,统计两组小鼠的死亡情况并分析生存率。2、巨噬细胞极化在EPO治疗DAH小鼠前后的变化。实验方法同1(1),在第14天解剖小鼠,肉眼观察肺组织出血情况,组织病理分析肺组织病理变化,TUNEL染色检测凋亡细胞数量,QPCR法检测肺组织中miR-155-3p、miR-15-3p、miR-494-3p、IL-12、IL-6、IL-10 和 TNF-α的表达水平,Western blot 法检测肺组织中p-JAK2、JAK2、p-STAT3、Bcl-2、Bcl-xl和Bax的表达水平,免疫组化法检测肺组织中M1型巨噬细胞(iNOS标记)和M2型巨噬细胞(CD 163标记)的数量,ELISA法检测BALF中IL-12、IL-6、IL-10和TNF-α的表达水平,Western blot法检测BALF中M1型巨噬细胞(iNOS和CD86标记)和M2型巨噬细胞(CD206和Arg-1)的表达水平。3、EPO通过miR494/JAK2/STAT3轴调节巨噬细胞极化。(1)EPO对巨噬细胞极化的影响。将LPS、IFN-γ和IL-4加入RAW 264.7细胞培养24 h,然后进一步用EPO刺激,通过ELISA法检测细胞因子(IL-12,IL-6,TNF-α和IL-10)的表达水平,流式细胞仪检测M1巨噬细胞(iNOS和CD86标记)和M2巨噬细胞(CD206和Arg1标记)的数量。(2)EPO通过JAK2/STAT3通路调节巨噬细胞极化。我们使用shRNA沉默了 RAW 264.7巨噬细胞中JAK2、STAT3和STAT6,再将LPS、IFN-y和IL-4加入RAW 264.7细胞培养24 h,然后进一步用EPO刺激。通过QPCR法检测JAK2、STAT3和STAT6的mRNA表达水平,流式细胞仪检测M2巨噬细胞(CD206和Arg1标记)的数量。(3)MiR-494通过JAK2/STAT3通路调节巨噬细胞极化。将miR-494-3p抑制剂加入RAW 264.7细胞,再将LPS、IFN-γ和IL-4加入RAW 264.7细胞培养24 h,然后进一步用EPO刺激。通过流式细胞仪检测M2巨噬细胞(CD206和Arg1标记)的数量,QPCR检测miR-494-3p、JAK2、STAT3 和 STAT6 的表达水平,Western blot 法检测 JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、STAT6 和 P-STAT6 的蛋白表达水平。结果1、(1)EPO治疗组和对照组肺组织呈正常乳白色,未见出血,组织病理示肺组织正常,未见炎症细胞浸润,DAH模型组肺组织呈暗红色,可见弥漫性出血,组织病理示肺泡腔内充满大量的红细胞并伴有炎症细胞浸润。(2)只有D1-14组(从第1天到第14天持续腹腔注射EPO)的治疗效果最好。(3)EPO治疗后DAH小鼠的生存率明显提高。2、与DAH模型组相比,EPO治疗组TUNEL染色阳性细胞、促凋亡蛋白(Bax)均显著减少,而抗凋亡蛋白(Bcl-2和Bcl-xl)显著增加;EPO治疗组促炎因子(IL-6、IL-12和TNF-α)和M1型巨噬细胞(iNOS和CD86标记)均显著减少,而抗炎因子(IL-10)和M2型巨噬细胞(CD206、CD163和Arg-1标记)均显著增加;EPO治疗组中miR-494-3p、miR-155-3p、miR-15-3p均显著减少,p-JAK2、p-STAT3均显著增加。3、(1)在LPS、IFN-y和IL-4对巨噬细胞的刺激下,EPO处理后促炎因子(IL-6、IL-12和TNF-α)和M1型巨噬细胞均减少,p-JAK2、p-STAT3、抗炎因子(IL-10)和M2型巨噬细胞均增加。(2)基因沉默巨噬细胞中的JAK2、STAT3和STAT6,在LPS、IFN-γ和IL-4对巨噬细胞的刺激下,EPO处理后M2型巨噬细胞(CD206和Arg-1标记)数量未见明显的增加。(3)在LPS、IFN-y和IL-4对巨噬细胞的刺激下,miR-494-3p抑制剂处理促进JAK2,STAT3和STAT6的mRNA表达,miR-494-3p抑制剂和EPO共同处理显著增加了 M2型巨噬细胞(CD206和Arg-1标记)的数量。结论1、EPO对Pristane诱导的DAH有明显的治疗作用。2、EPO可能通过调节miR-494/JAK2/STAT3轴促进巨噬细胞向极化发挥治疗作用。