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目的:构建组蛋白去乙酰化酶2(HDAC2)基因的短发夹RNA(short hairpin RNA,sh RNA),并对其在肝癌细胞株Hep G2中的干扰效率进行鉴定。探讨1,25(OH)2D3对HDAC2的抑制作用和抑癌基因p21WAFI/CIP1的表达情况,观察1,25(OH)2D3是否通过抑制HDAC2的表达进而促进p21WAFI/CIP1的高表达,从而调节Hep G2细胞的增殖和分化。方法:1、针对HDAC2 m RNA序列设计3对RNA干扰靶序列及一条阴性对照序列,定向克隆至经Age I与Eco RI双酶切线性化的慢病毒表达质粒p LKO.1-TRC cloning vector,构建靶向抑制HDAC2基因表达真核表达载体p LKO.1-sh RNA-HDAC2,酶切验证及测序鉴定。2、将鉴定正确的重组表达质粒p LKO.1-sh RNA-HDAC2采用脂质体法共同转染人胚肾细胞293T,包装含HDAC2-sh RNA的重组慢病毒颗粒。3、重组慢病毒颗粒感染Hep G2细胞,分别加入对应重组慢病毒及对照慢病毒。分别采用Realtime PCR和Western blotting检测HDAC2基因的m RNA和蛋白表达水平,鉴定、分析重组质粒的干扰效果。运用CCK-8法检测各组Hep G2细胞增殖抑制率,观察沉默HDAC2基因后对肝癌Hep G细胞生物学特性的影响。4、培养肝癌Hep G2细胞,经慢病毒感染和/或1,25(OH)2D3处理,通过Realtime PCR和Western blotting检测细胞经RNA干扰和/或1,25(OH)2D3处理后HDAC2及p21WAFI/CIP1基因的m RNA水平和蛋白的表达情况。结果:1、sh RNA退火连接克隆到慢病毒质粒p LKO.1,经酶切验证及测序鉴定表明筛选出的重组体测序结果与预期靶序列相同,p LKO.1–sh RNA重组质粒构建成功。2、获得有效浓度稳定表达HDAC2的sh RNA的重组慢病毒颗粒。3、Realtime PCR和Western blotting检测结果显示与对照组相比,3条干扰序列转染肝癌Hep G2细胞后均能明显抑制HDAC2基因和蛋白表达(P<0.05),其中以p LKO.1-HDAC2-sh RNA1、3的干扰效果最明显,两者相比较差异无统计学意义(P>0.05),表明HDAC2基因慢病毒干扰载体已成功构建。4、CCK-8测定结果显示,Hep G2细胞中的HDAC2蛋白表达下调可导致细胞增殖抑制。5、1,25(OH)2D3处理HDAC2基因沉默后Hep G细胞,与单独沉默HDAC2基因组相比较,结果从m RNA水平和蛋白水平均表明,1,25(OH)2D3处理不能进一步促进p21 WAFI/CIP1基因的高表达(P>0.05)。结论:1、沉默HDAC2基因可上调p21 WAFI/CIP1基因m RNA及蛋白水平的表达。2、1,25(OH)2D3能诱导p21 WAFI/CIP1的m RNA和蛋白的高表达,其机制可能与通过抑制HDAC2基因的表达有关。