目的:随着我国绵羊养殖业的集约化、规模化发展,各种繁殖调控技术不断应用到绵羊生产实践过程中。将同期发情、超数排卵、人工授精和胚胎移植技术进行系统集成,即MOET(Multiply Ovulation and Embryo Transfer)技术,MOET技术加速了遗传进程,加快了绵羊改良的速度。但MOET技术仍存在一些问题,如同期发情和超数排卵使用的激素种类和剂量没有较统一的方案;常规人工授精操作困难,技术要求严格,对受精率有一定影响且效率不高;以及供受体羊饲养标准不一等。为优化绵羊MOET技术方案体系,本研究首先选择不同的同期发情方案处理不同品种绵羊,同时结合腹腔内窥镜技术定时输精,然后统计其受胎率,筛选出同期发情率达85%左右和受胎率达到90%左右的组合进行推广。其次根据筛选出的同期发情方案处理多浪羊,采集处理前后试验母羊外周血并测定其中生殖激素水平变化情况,研究激素变化曲线与卵巢反应之间的关系。同期发情作为绵羊MOET中关键环节之一,其处理方案主要包括采用孕酮阴道栓(CIDR)延长黄体期和注射氯前列烯醇(PGF2α)缩短黄体期,由此可见黄体寿命的长短对于MOET成功与否起着决定性的作用。同时,本课题组最近发现差异性表达的miRNA-665/HPGDS可能与黄体寿命相关,因此,本试验以黄体细胞为试验材料,在分子水平探讨miR-665靶向HPGDS与黄体退化的相关分子机制,以期提高绵羊同期发情的效率,优化绵羊MOET技术方案体系。方法:(1)选择PGF2α+促黄体素(LH)法和CIDR+孕马血清促性腺激素(PMSG)法分别处理常年发情的湖羊和季节发情的新疆本地阿勒泰羊,研究不同处理方案对不同品种绵羊的同期发情效果。以公羊试情来统计发情率,同时在腹腔内窥镜定时输精后统计其受胎率,筛选同期发情率达到85%左右和受胎率到达90%左右的组合进行推广应用。(2)以多浪羊为研究对象,自然发情为对照组,外源激素处理为试验组,采用试验一中筛选出的CIDR+PMSG方案进行同期发情处理,在处理前后采集试验羊的血液,分析血清中FSH、LH、E2、P4的波动曲线,研究激素变化曲线与卵巢反应之间的关系,以此为依据优化绵羊MOET技术方案体系。(3)黄体寿命的长短对于MOET方案的成功起着重要的作用,基于黄体组织/细胞深入探究其相关分子调控机制,对指导MOET方案优化具有重要意义。本试验采用胶原Ⅱ酶消化法培养绵羊黄体细胞,并进行细胞鉴定,同时收集不同时间段的细胞培养液,通过ELISA检测其中孕激素(P4)浓度。黄体细胞培养成功后,添加前列腺素(PGF2α),检测P4水平的变化。(4)为进一步探讨黄体的分子调控机制,指导MOET方案优化,同时基于本课题组最近发现的差异性表达miR-665可能参与黄体寿命相关调控研究,本试验用miR-665转染黄体细胞,对转染后的细胞进行收集,通过qRT-PCR检测黄体退化相关基因的水平变化;同时通过ELISA检测转染细胞培养液中P4的浓度变化,以此来验证miR-665/HPGDS在黄体细胞中的功能性调控作用。结果:(1)湖羊采用PGF2α+LH法发情率为66%,人工授精后的受胎率为81.82%;湖羊采用CIDR+PMSG法发情率为88%,人工授精后受胎率为90.9%。阿勒泰羊选择PGF2α+LH法发情率为63%,人工授精后受胎率为80.95%;阿勒泰羊选择CIDR+PMSG法发情率为85%,人工授精后受胎率为 90.59%。(2)CIDR+PMSG处理组多浪羊同期发情率为90%,自然发情组多浪羊发情率为38%。CIDR+PMSG处理多浪羊,撤栓/PMSG肌注48h与埋栓前1 d、埋栓第7 d、埋栓第13 d(撤栓0 h)相比,试验羊外周血中E2、FSH、LH含量显著升高(P<0.05),P4含量显著下降(P<0.05)。(3)胶原酶Ⅱ消化法成功培养绵羊黄体细胞,并通过免疫组化检测成功鉴定细胞。不同时段的细胞培养液中,前5 d P4浓度持续上升,并在第5 d达到最大值,之后逐渐下降。黄体细胞中添加PG后,P4整体水平呈逐渐下降趋势。(4)用miR-665转染黄体细胞,转染组细胞培养液中P4浓度明显下降,未转染组中P4浓度逐渐上升;对转染后的细胞通过qRT-PCR检测表明:HPGDS,PGFS和VEGF基因显著上调(P<0.05);基因3β-HSD有下调趋势,但变化不显著(P>0.05);LH-R和StAR基因显著下调(P<0.05)。结论:(1)使用CIDR+PMSG法处理湖羊和阿勒泰羊发情率达都到85%,人工授精后受胎率都达到90%,可以进行应用推广。(2)采用CIDR+PMSG组合处理多浪羊,取得的发情效果好;撤栓/PMSG肌注48h时多浪羊的生殖激素分泌基本达到同步状态,与发情现象相呼应,可以此优化绵羊MOET方案。(3)胶原酶Ⅱ消化法可成功培养绵羊黄体细胞,免疫组化检测可成功鉴定黄体细胞;黄体细胞培养第5 d,细胞形态结构明显、活力高,最适合进行以其为试验材料的各种试验。黄体细胞添加PG后,细胞明显发生凋亡。(4)黄体细胞转染miR-665后,黄体退化相关基因HPGDS、PGFS和VEGF表达上调,黄体合成相关基因LH-R和StAR,3β-HSD表达下调;同时转染后细胞培养液中P4浓度呈下降趋势,这证实miR-665/HPGDS与黄体细胞确实存在靶向调控作用。