本文对胎盘LINE-1甲基化状态及不同一性双胎产前治疗进行了研究。文章分为两个部分：　　 第一部分：胎盘LINE-1甲基化状态的研究。　　 胎盘形成、生长发育过程与肿瘤的发生有很多的相似之处，例如增殖速率高、细胞生长缺乏接触抑制，具有较强的迁移性和侵袭性，拥有丰富的血管网及血供等，而且在免疫上能逃避自体免疫系统的攻击。一些在肿瘤发生过程中出现的分子机制或表观遗传学改变，也会表现在胎盘发育过程之中，并可能对胎盘发育及与胎盘有关的妊娠期疾病的研究有重要的肩示。在肿瘤发生、发展过程中，基因组内分散重复序列(Interspersed Repeat Sequences)的甲基化程度下降是肿瘤表观遗传学的重要特点之一。在人类基因组中有相当含量的分散重复序列，约占整个基因组45％，其中长散在核重复序列-1(Long Interspersed Nuclear Element-1，LINE-1)的拷贝数约有500000-600000，约占整个基因组的18％-20％。完整的LINE-1具有反转录转座子(retrotransposon)活性，可以引起基因组发生插入、重排等突变，与遗传性疾病、系统性自身免疫性疾病、细胞凋亡及肿瘤发生有关。由于LINE-1遍布于基因组，以往研究中常以LINE-1的甲基化程度去代表基因组整体的甲基化状态。在正常组织中LINE-1各CpG位点通常呈甲基化，而在肿瘤组织中，LINE-1甲基化程度降低，与肿瘤的发生、进展密切相关。LINE-1甲基化程度的降低可引起LINE-1表达增强，而LINE-1的表达可能是引起肿瘤细胞增殖的因素之一。LINE-1的甲基化状态虽然在肿瘤中研究甚多，但在胎盘发育过程及病理妊娠胎盘中，其甲基化状态还有待研究。有研究发现在部分性葡萄胎胎盘中，LINE-1的甲基化程度较正常胎盘增加，提示LINE-1可能在胎盘发育中也存在变化。那么在肿瘤发生过程所出现的LINE-1甲基化程度下降是否也会发生在胎盘发育过程中呢?胎盘LINE-1的甲基化程度在子痫前期中有否改变?在肿瘤细胞中，LINE-1的甲基化状态与LINE-1的表达有关，而且可能是引起细胞异常增殖的因素之一，那么在胎盘中，整体细胞增殖状态是否与LINE-1的甲基化和转录活性有关呢?这些问题都值得我们去探讨。　　 目的：　　 ⑴通过亚硫酸氢盐限制分析法(combined bisulfite restriction analysis，COBRA)、重亚硫酸氢盐测序等方法，比较第一、第三孕期胎盘LINE-1的甲基化状态，探讨不同发育阶段的胎盘LINE-1甲基化水平的变化；　　 ⑵对比正常第三孕期与子痫前期胎盘的LINE-1甲基化状态，以此探讨子痫前期胎盘LINE-1甲基化状态是否存在改变；　　 ⑶以5-甲基胞嘧啶(5-Methylcytidine，5mC)免疫组化染色评估胎盘的整体甲基化程度，与其LINE-1甲基化程度比较，观察LINE-1甲基化水平与整体甲基化水平的变化是否一致；　　 ⑷探讨DNA甲基转移酶(DNA Methyltransferases，DNMTs)在第一孕期、第三孕期及子痫前期中的表达变化及其与LINE-1甲基化的关系；　　 ⑸研究LINE-1甲基化状态、LINE-1转录活性与胎盘增殖状态之间的关系。　　 结果：　　 ⑴预试验结果提示以COBRA法能较好地反映LINE-1的甲基化程度；　　 ⑵第三孕期胎盘的LINE-1甲基化程度低于第一孕期(30.2％±6.4％vs59.3％±15.4％，P＜0.05)；　　 ⑶子痫前期胎盘的LINE-1甲基化程度与正常第三孕期无明显差别(31.8％±2.4％vs30.2％±6.4％，P＞0.05)；　　 ⑷比较第一孕期、第三孕期及子痫前期胎盘的5mC免疫组织化学染色结果，三者之间无明显差别；　　 ⑸早、晚孕期胎盘的DNMTs转录活性比较：①以磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)为内参，DNMT1、DNMT3a在第三孕期的表达均明显高于第一孕期，分别是第一孕期的4.66倍(P＜0.05)和15.20倍(P＜0.05)，DNMT3b在早晚孕期的表达无明显差别(P＞0.05)。②以反映细胞增殖状态的增殖细胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen，PCNA)为内参排除细胞增殖因素影响，DNMT1、DNMT3b在第三孕期的表达均低于第一孕期，分别是第一孕期的0.70倍(P＜0.05)和0.24倍(P＜0.05)，DNMT3a在第三孕期的转录活性依然较高，是第一孕期的2.43倍(P＜0.05)。　　 ⑹子痫前期胎盘与第三孕期胎盘的DNMTs转录活性比较：①用GAPDH为内参，子痫前期胎盘中DNMT1、DNMT3a的表达低于正常组，分别是正常组的0.42倍(P＜0.05)、0.20倍(P＜0.05)。②用PCNA为内参排除细胞增殖影响后，子痫前期胎盘的DNMT3a转录活性仍低于正常组，是正常组的0.63倍(P＜0.05)。　　 ⑺相关分析提示，排除细胞增殖影响后，DNMT3a的转录活性与LINE-1的甲基化程度成正相关关系(P＜0.05)。　　 结论：　　 ⑴LINE-1的甲基化状态在不同时期的胎盘存在差别，晚孕胎盘的LINE-1甲基化程度要低于早孕胎盘，提示在胎盘发育过程中LINE-1的甲基化状态可能发生变化；　　 ⑵子痫前期胎盘的LINE-1甲基化程度与正常第三孕期胎盘比较无明显变化，未发现LINE-1甲基化状态与子痫前期的发病有关；　　 ⑶与LINE-1在晚孕胎盘呈相对低甲基化状态的特点不同，5甲基胞嘧啶(5mC)免疫组织化学染色的结果提示，第一孕期、正常第三孕期胎盘的整体甲基化程度无明显差别，推测在胎盘发育过程中LINE-1的甲基化状态可能有别于基因组的整体甲基化状态；　　 ⑷晚孕胎盘中DNMTs的转录活性高于早孕期，但主要是胎盘增殖、细胞数量增加所致。排除细胞增殖因素影响后，DNMT3a转录活性随孕周增长而增加，在子痫前期中下降，提示DNMT3a可能参与胎盘发育及子痫前期发病过程。孕期胎盘LINE-1甲基化状态的变化可能涉及多种因素，未能单独用DNMTs转录活性的改变去解释。　　 ⑸第三孕期胎盘的整体增殖状态及LINE-1转录活性均高于第一孕期。胎盘的整体增殖状态、LINE-1甲基化状态及LINE-1转录活性三者之间有相关性，在胎盘中，LINE-1甲基化状态可能参与LINE-1转录的调控，而LINE-1转录活性可能与胎盘的增殖及分化状态有关。　　 第二部分：复杂性不同一性双胎的产前宫内治疗研究。　　 双胎不同一性是双胎妊娠中特有的病理现象，是指双胎在生长发育(体重差别＞20％)、基因型和表型中的不一致。发育不同一双胎的临床预后要差于发育较为平均的双胎，而且妊娠结局往往与绒毛膜性质密切相关。其中单绒毛膜双胎(Monochorionic Twins，MCT)预后更为复杂，由于其胎盘上存在血管吻合，可发生双胎输血综合征(Twin-Twin TransfusionSyndrome，TTTS)，双胎反向灌注序列征(Twin Reversed Arterial Perfusion，TRAP)等特有并发症，而且一胎病情的进展可影响另一胎的健康，甚至引起整个妊娠的丢失。在目前复杂性不同一性双胎的发病原因尚不完全清楚，无法做到病因预防的情况下，有必要对复杂性不同一性双胎作出及时有效的治疗以改善其预后，我们将在本部分论文以MCT为例，探讨不同一性单绒毛膜多胎的产前宫内治疗，评估其应用及临床预后。　　 目的：　　 ⑴使用快速羊水减量术对TTTS进行产前治疗，评估其对不同级别TTTS的疗效及手术并发症；　　 ⑵使用脐带电凝减胎术对TTTS、TRAP等复杂性MCT进行产前宫内治疗，评估手术效果及安全性。　　 结果：　　 ⑴TTTS病例在快速羊水减量术后至少一胎存活率为61.5％(8/13)，羊水减量后轻型TTTS(5例)平均可继续妊娠10.1周，明显长于重型TTTS(8例)的0.7周(P＜0.05)，轻、重型TTTS的术后存活率无明显差别(P＞0.05)，手术并发症率为12.9％；　　 ⑵脐带电凝减胎术的手术成功率为93.3％(14/15)，术后一胎存活率为84.6％，手术并发症发生率为20.0％。　　 结论：　　 ⑴快速羊水减量术可在一定程度上延长孕周，但并未针对TTTS的病因，适用于轻型TTTS的产前治疗，而对重型TTTS疗效较差。　　 ⑵脐带电凝减胎术成功率较高，术后复发率低，合理使用有利于改善复杂性单绒毛膜多胎的临床预后，可作为重型TTTS的治疗方案之一。