青光眼是一种发病机制较为复杂的眼科疾病,常因病理性眼压升高造成视神经损害并伴发不可逆性的视野缺损。流行病学调查研究显示,即使在眼压控制在较低水平（≤21mm Hg）时,部分青光眼患者仍旧存在视神经进行性损害和视野进行性缩窄。现有的诊疗手段虽能将眼内压降至靶眼压水平,但是仍有潜在失明风险,给社会和家庭造成了巨大的负担。基于中医药“多靶点、多环节、多通路”的机制特点,本文先期采用文献计量学手段对近10年中医药诊疗青光眼的研究概况及热点进行梳理,随后运用整合网络药理学知识对导师临床经验方益气明目颗粒可能药理机制进行探索,最后再结合细胞生物学的实验方法对前期的预测机制进行验证,从而构建一条“文献计量学挖掘—网络药理学预测—细胞实验学验证”的研究路线,全面阐明中医药在诊疗青光眼方面的确切机制与巨大优势。第一部分基于文献计量学的中医药诊疗青光眼近10年研究热点及趋势分析目的:采用可视化知识图谱的方式,对近10年中国知网数据库关于中医药诊疗青光眼的文献进行系统梳理,深入挖掘本领域研究热点与前沿趋势,为中医药诊疗青光眼的未来研究提供一定的参考依据。方法:以VOSviewer1.6.14软件和Cite Space5.8.R3软件作为可视化知识图谱绘制工具,完整检索2012年1月1日至2021年12月31日共十年时间发表于中国知网数据库的中医药诊疗青光眼相关的研究文献。以“Refworks”格式所需文献后,按照纳入、排除标准初步剔除不需要文献,随后进行数据统一清洗和文本格式转换,达到能够后续软件分析处理的程度。最后分别用Excel 2019进行描述性统计分析,VOSviewer1.6.14及Cite Space5.8.R3软件进行可视化知识图谱绘制。结果:从描述性统计分析结果来看:本次研究共纳入近10年相关文献404篇,历年发表的文献数量十分稳定,多在35篇~45篇之间;彭清华（24篇）、彭俊（17篇）、李翔（16篇）和张丽霞（11篇）等4位研究者累计发文量超过了10篇,与之相对应的发文量最多的三家科研机构分别是湖南中医药大学（34篇）、中国中医科学院（32篇）和成都中医药大学（29篇）;从期刊发文量来看,发表于《中国中医眼科杂志》（47篇）上的数量远远高于其它期刊,这与该期刊的专业性和业内影响力密不可分。从可视化知识图谱结果来看:合作关系网络形成了以彭清华、李翔、张丽霞等研究者为代表的主要几个研究方阵,各团队内部合作较为密切,但是与其余团队就呈分散态势;聚类结果表明,“视神经保护”是该领域研究的关键节点,临床或基础研究则围绕其在四周呈延伸状,中医治法主要包括活血化瘀、疏肝健脾、理气等,中成药的使用包括复方血栓通胶囊、青光安颗粒等,针灸疗法也成为了青光眼诊疗过程中极其重要的治疗手段之一,在机制研究方面,主要围绕RGCs凋亡展开,与自噬、氧化应激、视神经损伤等密切相关。结论:1、不同地域与院校之间需打破藩篱,加强交流与合作,进一步发挥中医药在治疗青光眼方面的优势;2、完善中医证候诊断标准的研究,尽可能地将中医辨证与西医辨病有机融合,从而实现中医诊疗的规范化与标准化;3、中药活性成分或有效入血成分是发挥药理作用的关键所在,可以在已有研究基础上,加大对药物结构和新功能的挖掘,使其尽可能多的服务于临床;4、多指标评价治疗效果,尤其是患者心理状况的改变,尤其对于远期疗效的追踪与评估;5、复杂药理机制的探索、高质量循证医学与真实世界研究、新药物的多疗效筛选将成为未来发展的趋势。第二部分基于整合网络药理学探究益气明目颗粒治疗气虚血瘀型青光眼的潜在作用机制目的:采用整合网络药理学探究益气明目颗粒治疗气虚血瘀型青光眼的潜在作用机制。方法:登录中医药整合网络药理学计算平台（TCMIP V2.0）,建立益气明目颗粒不同药材化学成分及候选靶点数据库;利用DAVID 6.8对中药潜在的靶标进行GO和KEGG富集分析;运用在线绘图网站Omic Share Tools进行GO和KEGG气泡图可视化绘制;在TCMIP V2.0的疾病相关分子库中检索关键词“glaucoma”,疾病名称依次选择“glaucoma”、“glaucomatous visual field defect”、“open angle glaucoma”,并通过“整合药理学分析工具集合”中的“证候相关分子挖掘及功能分析”形成气虚血瘀型青光眼的中医证候靶点;基于STRING数据库构建益气明目颗粒与气虚血瘀型青光眼的靶标相互作用信息,并对核心化学成分进行QED评估;借助Cytoscape3.7.0绘制“中药-成分-靶点-通路”的多维网络图。结果:基于TCMIP V2.0共获得益气明目颗粒282个化学成分,对应靶点815个。对益气明目颗粒候选靶标进行GO和KEGG富集分析,发现主要作用于动作电位过程中的膜去极化、能量代谢、线粒体等相关途径。基于TCMIP V2.0的“疾病相关分子库”和“证候相关分子挖掘及功能分析”模块,将两者得到的疾病基因进行标准化处理及合并去重,最终得到571个相关气虚血瘀型青光眼疾病基因。采用Degree值从大到小排列选取前150个节点作为核心靶标。其中益气明目颗粒直接作用靶标有113个,气虚血瘀型青光眼靶标50个,两者共有靶标13个,分别是ALB、PIK3CA、TLR4、PRKACA、SDHC、NR3C1/GR、ABL1、HNF4A、SDHB、VCP、RHO、HK1、ACO2。对Degree前150的核心靶标进行GO功能分析及KEGG通路富集分析,结果显示核心靶标主要富集在Rap1信号通路、HIF-1信号通路、PI3K-Akt信号通路等。从益气明目颗粒治疗气虚血瘀型青光眼“中药-成分-靶点-通路”多维网络可以看出各组成部分之间的相互关系。不同的化合物通过作用于不同靶点如TNF-α、IL-6、TLR4、NFKB1、AKT等,进而参与不同的通路,起到治疗疾病的作用。结论:1、益气明目颗粒可以通过“多组分、多环节、多靶点、多通路”途径发挥中医药整体诊疗气虚血瘀型青光眼的优势;2、益气明目颗粒可能通过调节局部线粒体代谢水平,主要与RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正/负调控、转录和DNA模板、ATP结合等,进而改善细胞内微环境能量代谢状况;3、富集结果显示,该方与HIF-1信号通路、PI3K-Akt信号通路等密切相关,通过减少氧化应激水平,下调TNF-α、IL-6、TLR4等炎症因子表达,减少青光眼视神经损害。第三部分益气明目颗粒含药血清对缺氧诱导损伤RGC-5细胞的保护作用目的:评估益气明目颗粒含药血清对氯化钴诱导的RGC-5缺氧损伤细胞模型的保护作用。方法:建立CoCl2溶液诱导的RGC-5缺氧损伤细胞模型,将大鼠分为空白血清组和益气明目颗粒含药血清组,予以等体积生理盐水或益气铭刻颗粒汤液灌胃,分离血液制备含药血清。将培养细胞分为正常组、对照组、高中低含药血清剂量组共5组,用不同体积分数的含药血清进行干预,并检测所需指标。分别包括:CCK-8法检测最佳造模浓度与时间,不同浓度含药血清对正常RGC-5和缺氧损伤RGC-5细胞活力的影响;流式细胞术检测含药血清对CoCl2诱导缺氧RGC-5细胞凋亡的影响;生物透射电镜对CoCl2诱导缺氧RGC-5细胞超微结构的影响;比色法和WST-1法对CoCl2诱导缺氧RGC-5细胞GSH-Px活力和SOD水平的影响;含药血清对CoCl2诱导缺氧RGC-5细胞凋亡相关因子m RNA表达的影响;图表绘制和数据分析则采用Graph Pad Prism 9软件进行处理。结果:1、与正常组（0μmol/L CoCl2）溶液相比,浓度为400μmol/L的CoCl2溶液并培养24h后达到50%致死率,故选择400μmol/L的CoCl2溶液并培养24h作为RGC-5细胞缺氧损伤模型建立的条件;2、1.25%、2.5%和5%三个浓度的含药血清可以剂量依赖性地促进正常组RGC-5细胞的生长。与400μmol/L的CoCl2溶液共同孵育24h后,2.5%和5%含药血清组可以促进CoCl2诱导的缺氧细胞生长（P＜0.05）;3、流式细胞术结果表明,与缺氧模型组细胞凋亡率相比,采用1.25%、2.5%和5%三个不同浓度的含药血清共同孵育后,凋亡率明显减少;4、生物透射电镜结果显示,与正常组相比,缺氧模型组胞核肿胀,结构紊乱、萎缩甚至畸形,线粒体出现肿胀、嵴断裂最终空泡样改变,细胞质分布杂乱,核仁固缩或者消失;益气明目颗粒含药血清干预后,与模型组相比,细胞形态较为规整,发现少量线粒体空泡样改变,线粒体嵴清晰可见,核仁圆润明显,染色质有少部分凝聚;5、与正常组相比,CoCl2溶液干预后细胞内SOD和GSH-Px活力均降低（P＜0.01）;与模型组相比,给予不同浓度益气明目颗粒含药血清干预24h后,SOD和GSH-Px活力呈现不同程度的增长（P＜0.01）;6、与空白血清组相比,CoCl2溶液干预后细胞内HIF-1α、caspase-3与bax表达均增加（P＜0.01）,Bcl-2表达下降（P＜0.05）;与缺氧模型组相比,2.5%与5%浓度含药血清可以增加Bcl-2的表达（P＜0.01）,降低HIF-1α、caspase-3与bax表达（P＜0.05、P＜0.01）。结论:1、益气明目颗粒含药血清可以阻止CoCl2诱导的RGC-5细胞凋亡;2、在超微结构方面,含药血清可以明显改善胞核肿胀、结构紊乱、虽有少量线粒体空泡样改变,但线粒体嵴清晰可见,核仁圆润明显,染色质有少部分凝聚;3、通过提升SOD和GSH-Px活力,保护RGC-5细胞免受氧化应激损伤;4、通过增加Bcl-2的表达,降低HIF-1α、caspase-3与bax表达,减轻缺氧状态下的细胞损伤。