研究背景高血压与缺血性心脏病、心肌梗死和心力衰竭等多种心血管疾病之间具有显著的、独立的、线性的联系,是心血管疾病和全因死亡率的主要可预防风险因素。肾素-血管紧张素-醛固酮（RAS）系统是高血压发生和发展的最相关因素之一。高血压可导致血管功能障碍,血管功能障碍又可加重高血压的发展,二者互为影响呈双向关系。炎症可导致高血压的形成,氧化应激和内皮功能障碍又参与炎症级联,均是高血压发生发展的主要原因。而单核细胞黏附到血管内皮细胞经常导致炎症反应,进而促进高血压和血管重构的形成与发展。血管细胞黏附分子-1（Vascular cellular adhesion molecule-1,VCAM-1）在炎症性疾病中白细胞黏附和迁移中起重要作用。然而,其在血管紧张素Ⅱ（Ang Ⅱ）诱导的高血压和血管功能障碍中的作用仍不清楚。研究目的本研究课题以血管细胞黏附分子（VCAM-1）为研究靶点,重点探讨其对Ang Ⅱ诱导的小鼠高血压及血管重构的作用及分子机制。研究方法1)小鼠高血压模型构建野生小鼠背部皮下植入渗透压泵,持续灌注Ang Ⅱ（490 ng/kg·min）或者生理盐水直至14天,诱导高血压模型,应用尾套法每隔一天监测并记录血压,以确保造模成功。2)小鼠动脉组织及血清中VCAM-1水平检测应用免疫组织化学染色、免疫印迹检测动脉VCAM-1的蛋白表达水平;应用实时荧光定量PCR（q PCR）技术检测小鼠动脉组织VCAM-1的m RNA表达水平;应用ELISA检测小鼠血清中VCAM-1含量变化。3)在小鼠高血压模型中应用VCAM-1中和抗体野生小鼠通过背部皮下植入渗透压泵,持续灌注Ang Ⅱ（490 ng/kg·min）或者生理盐水直至14天,诱导高血压模型,同时经腹腔注射高剂量（0.2 mg）和低剂量（0.1 mg）VCAM-1中和抗体,用尾套法每隔一天监测并记录各组小鼠的血压变化,以确保造模成功。4)血管收缩及舒张功能检测使用5%异氟烷麻醉各组小鼠,开胸分离胸主动脉并剥离血管周围脂肪组织,剪下2-3 mm主动脉小心安装在血管环力传感器上,平衡血管张力后首先用去甲肾上腺素（NE）激活血管,然后分别梯度增加乙酰胆碱（ACh）和硝普钠（SNP）药物浓度,检测各组小鼠主动脉的收缩及舒张功能变化。5)检测主动脉病理学改变情况通过H＆E染色检测主动脉壁厚度的改变;应用Masson染色评价主动脉纤维化及胶原沉积的程度,同时应用q PCR检测纤维化标志物包括I型胶原（Collagen I）、ⅡI型胶原（Collagen ⅡI）和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的m RNA表达水平;应用Mac-2免疫学染色检测主动脉中炎症细胞浸润情况及应用q PCR检测炎症标志物白介素-1β（IL-1β）,肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）的m RNA表达水平;应用DHE荧光染色以及q PCR检测氧化应激标志物包括NADPH氧化酶亚基（NOX1,NOX2和NOX4）的m RNA表达水平。6)体外细胞实验研究VCAM-1影响巨噬细胞黏附、迁移以及对内皮细胞损伤的机制（1）巨噬细胞黏附:从小鼠胫骨和股骨中分离并提取巨噬细胞,在1640完全培养基中培养3-5代。复苏人脐静脉内皮细胞（HUVEC）,于ECM完全培养基中培养2-3代,加入VCAM-1中和抗体（5μg/ml）或对照Ig G抗体反应4小时,再加入Ang Ⅱ（100 n M）或者生理盐水刺激24小时。巨噬细胞使用PKH-26染料染色,然后以10:1的比例加入处理好的HUVEC中,在37℃培养箱中共同孵育1小时。使用PBS溶液洗去未黏附的巨噬细胞,然后经多聚甲醛固定后于镜下检测已黏附的巨噬细胞数目并记录,明确VCAM-1对巨噬细胞黏附的影响。（2）巨噬细胞迁移:将提前培养的巨噬细胞（5×10~4）加入Transwell小室上室,HUVEC加入Transwell小室下室并予以Ang Ⅱ（100 n M）及VCAM-1中和抗体（5μg/ml）或Ig G处理,将巨噬细胞与HUVEC置于37℃培养箱中共同孵育24小时后,予以多聚甲醛固定细胞并使用DAPI荧光染色检测各组中迁移的巨噬细胞数目差异。（3）内皮细胞损伤:巨噬细胞予以VCAM-1中和抗体（5μg/ml）或Ig G处理4小时后,加入Ang Ⅱ（100 n M）刺激24小时,然后将巨噬细胞的培养液加入至提前培养好的HUVEC爬片中孵育24小时。取出HUVEC爬片予以多聚甲醛固定、免疫荧光通透剂通透、羊血清封闭等处理后,应用免疫荧光染色检测内皮细胞DNA损伤标志物（γ-H2AX）及内皮细胞氧化应激标志物（p-ATM）。7)统计学分析采用Graph Pad Prism 8.0软件进行统计学分析。两组数据正态分布时采用独立t检验,非正态分布时采用Wilcoxon秩和检验分析。多组数据正态分布时采用单因素方差分析（one-way ANOVA）和post-hoc Turkey multiple comparison分析,非正态分布时采用Kruskal-Wallis检验分析。所有数据均以均数±标准差（M±SD）表示。p＜0.05为差异有统计学意义。研究结果1)Ang Ⅱ可促进VCAM-1在主动脉和血清中的表达野生雄性小鼠持续灌注Ang Ⅱ（490 ng/kg·min）14天后小鼠主动脉内VCAM-1 m RNA和蛋白表达水平,血清中VCAM-1浓度显著高于生理盐水对照组,提示VCAM-1的表达增加可能在Ang Ⅱ诱导的高血压中发挥重要作用。2)阻断VCAM-1可降低Ang Ⅱ诱导的高血压在小鼠高血压模型中应用VCAM-1中和抗体（0.1/0.2 mg）后,应用尾套法每隔一天监测并记录各组小鼠的血压变化,结果显示与生理盐水组相比,Ang Ⅱ诱导后小鼠收缩压（SBP）显著增加,而经VCAM-1中和抗体处理后小鼠收缩压呈剂量依赖性降低。此外VCAM-1中和抗体处理显著抑制了Ang Ⅱ诱导的小鼠血清VCAM-1水平的上调,提示阻断VCAM-1表达可保护小鼠高血压。3)应用VCAM-1中和抗体可减轻Ang Ⅱ诱导的血管壁肥厚Ang Ⅱ灌注14天后,小鼠主动脉血管壁厚度较生理盐水组明显增厚。相反,VCAM-1中和抗体组小鼠血管壁厚度显著减轻,且呈剂量依赖性。4)抑制VCAM-1可减少Ang Ⅱ诱导的血管胶原沉积及纤维化Masson染色显示应用VCAM-1中和抗体后可剂量依赖性减轻Ang Ⅱ诱导血管内胶原沉积。此外,Ang Ⅱ灌注可显著上调主动脉内纤维化标志物Collagen I、Collagen ⅡI、α-SMA的m RNA水平,而VCAM-1中和抗体可显著减轻这一作用,Ig G组则未见明显变化。5)VCAM-1中和抗体可减少Ang Ⅱ诱导的巨噬细胞浸润Ang Ⅱ组小鼠主动脉Mac-2阳性区域、主动脉内促炎性细胞因子如IL-1β、TNF-α和MCP-1的m RNA表达水平明显高于生理盐水对照组小鼠,而应用VCAM-1中和抗体后可显著减轻上述炎症反应并呈剂量依赖性。6)抑制VCAM-1可改善Ang Ⅱ诱导的血管氧化应激反应与生理盐水对照组小鼠相比,Ang Ⅱ灌注14天后小鼠主动脉内ROS含量增加、NADPH氧化酶亚基（NOX1,NOX2和NOX4）m RNA表达上调,而经VCAM-1中和抗体处理后可明显减少上述改变。其次,与Ig G处理组相比,应用VCAM-1中和抗体处理后小鼠血清丙二醛（MDA）含量降低而血清谷胱甘肽（GSH）含量增加。7)VCAM-1中和抗体可改善Ang Ⅱ诱导的血管内皮功能障碍我们通过分离小鼠主动脉,应用乙酰胆碱（ACh）或硝普钠（SNP）刺激主动脉检测各组小鼠血管舒张功能。结果显示与生理盐水组相比,Ang Ⅱ灌注显著损害了ACh诱导的内皮依赖性血管舒张作用,而应用VCAM-1抗体可剂量依赖性地改善血管舒张功能。同时,Ang Ⅱ对SNP诱导的内皮非依赖性血管舒张反应无明显影响。8)VCAM-1中和抗体抑制巨噬细胞向HUVECs黏附与迁移体外细胞实验发现与生理盐水对照组相比,Ang Ⅱ刺激显著增加了HUVECs上黏附、迁移的巨噬细胞数量,但VCAM-1中和抗体处理后显著减轻了这一作用。9)阻断VCAM-1改善HUVECs的DNA损伤和氧化应激经Ang Ⅱ处理后显著上调了HUVECs细胞中内皮细胞DNA损伤标志物（组蛋白γ-H2AX）、内皮细胞氧化应激标志物（p-ATM）以及NOX1、NOX2和NOX4等氧化应激因子的表达,而VCAM-1中和抗体处理后有效地抑制了这种高表达。结论阻断VCAM-1可能通过抑制巨噬细胞黏附和迁移,降低促炎性细胞因子和ROS水平来改善AngⅡ诱导的高血压及血管功能障碍。因此,选择性抑制VCAM-1可能是临床中高血压防治的一种新的治疗策略。