自噬（Autophagy，自体吞噬）是指吞噬细胞内蛋白或细胞器并进行降解的过程。当生物应对不良环境（如：营养缺乏等）时，可以通过分解细胞内一些非重要的蛋白及细胞器来维持细胞的存活。也有报道当负面的影响因素持续存在时，自噬过强则会诱导细胞发生凋亡或者坏死。虽然自噬的机制和作用研究已经有大量报道，但是自噬的这种机制应用于南极鱼类抗寒抗冻方面的研究却甚少，探讨鱼类抗寒抗冻与自噬之间的相关性是研究鱼类抗寒机制的一个新领域，对于更全面地研究鱼类抗寒机制有着重要意义。　　本研究通过在细胞中过表达自噬特异性标志物GFP- LC3（微管相关蛋白1轻链3，microtubule-associated protein1 light chain3）以观察低温环境下自噬的发生来探讨自噬与细胞抗寒的关系。运用pEGFP-LC3、mCherry-hLC3B-pcDNA3.1重组质粒用于表达融合蛋白GFP-LC3及mChenry-LC3，并将其转染于斑马鱼胚胎成纤维样 ZF4细胞中，分别设正常与低温处理两组；低温处理后多个观察点显微镜下观察野生型细胞低温处理与正常培养细胞的自噬小体形成的情况，与溶酶体共定位排除了由于低温造成膜流动性变差引起的荧光点聚集，证明了低温能够诱导ZF4细胞发生自噬。对低温处理24 h的ZF4细胞内的自噬上游调控基因beclin1与标记基因LC3进行RT-QPCR检测，证明低温可以引起细胞内自噬相关基因表达上调，对低温下处理1-13 d的ZF4细胞内的LC3蛋白进行western blot检测，发现低温胁迫下，细胞内LC3I转换为LC3II的进程加快，且10℃处理下的细胞内的这个过程较18℃明显快速，证明了冷刺激下细胞内自噬的发生。对低温胁迫下细胞内的自噬水平以及细胞的存活率进一步的动态监测显示：不同程度的急性冷刺激下，ZF4细胞内的自噬出现不同程度的上调，其上调程度与低温胁迫程度密切相关，同时发现ZF4细胞自噬出现的时间与开始死亡的时间之间似乎有着一定的联系。为了知道自噬在细胞受到急性冷刺激后的作用机制，通过bafilomycin A1对自噬进行特异性的阻断并给予急性冷刺激，存活率检测发现自噬特异性阻断后，细胞的存活率显著下降。随后，我们设计了自噬上游基因beclin1的shRNA，对细胞内的beclin1基因进行敲降并给予冷刺激下，存活率检测显示，急性冷刺激下，自噬被抑制的ZF4细胞的存活率较野生型明显降低，证明了急性冷刺激下自噬对细胞的保护作用。为了进一步验证低温刺激下自噬的功能，过表达beclin1后给予细胞不同程度的低温刺激并统计其存活率，结果发现，过表达beclin1的ZF4细胞的存活率明显上调，即自噬上调的细胞有更强的低温耐受力，证明了自噬在低温下对细胞的保护作用。　　基于已发现的饥饿条件下自噬与ROS之间的关系，通过探讨低温下自噬与ROS之间的关系，来了解低温下自噬的发生机制及作用功能。在急性冷刺激下，用药物NAC(N-乙酰基-L-半胱氨酸)清除细胞内ROS(活性氧)后监测细胞内的自噬情况，发现ROS清除后，细胞内检测不到自噬小体的发生，即低温刺激下细胞内的自噬是由ROS诱导的。bafilomycin A1阻断低温胁迫下细胞内的自噬，并用DCFH-DA染色及流式细胞仪检测细胞内的ROS水平，结果显示，自噬被阻断后，细胞内的ROS水平明显上调，即自噬参与了低温下细胞内ROS的清除，综上结果发现，在急性冷刺激下，ZF4细胞内的自噬与ROS为负反馈调节模式，ROS诱导ZF4细胞发生自噬，自噬则反过来清除细胞内的ROS。鉴于ROS来源于受损伤的线粒体，而ROS又与自噬相互作用，为了了解自噬与线粒体之间的关系，对低温下自噬小体与线粒体进行共定位并给予低温刺激，发现斑马鱼内的自噬小体与线粒体发生了一定程度的共定位，说明低温下，自噬参与了损伤线粒体的清除。将低温胁迫下的细胞用药物bafilomycin A1对自噬进行阻断，对线粒体进行mitotracker染色并经流式细胞仪检测，发现自噬阻断后，细胞内的线粒体含量明显较未阻断的细胞上调，进一步证明了自噬小体清除线粒体的作用。　　综上，本研究证明了低温可以诱导ZF4细胞内的线粒体发生损伤并释放出ROS，ROS诱导细胞发生自噬，自噬则反过来清除细胞内的线粒体与ROS。