固定化酶不仅继承了游离酶高活性和良好专一性等优点,还具有稳定性好、可分离回收、可重复使用以及可构建多酶反应体系等诸多特性,在生命科学、化学和临床医疗等领域得到广泛关注。然而传统固定化方法制备的固定化酶仍存在一定问题,难以充分发挥固定化酶的优势。因此,如何构建制备过程简单高效、反应条件温和、酶促活性高、重复使用性好及可逆固定化的固定化酶体系成为固定化酶领域亟需解决的问题。本论文充分结合磁性纳米粒子和DNA定向固定化(DNA directed immobilization,DDI)技术的特点,构建新型的固定化酶策略,进而显著提高固定化酶的整体性能。论文研究工作主要包括以下几个方面:(1)利用DDI技术将胰蛋白酶固定在三代聚酰胺胺树枝状大分子(PAMAM)修饰的磁性微球表面,制备固定胰蛋白酶反应器并用于实际蛋白质酶切分析研究。分别对酶促反应条件、聚酰胺胺树枝状大分子代数以及DNA长度对固定化酶活性的影响进行考察。在最优条件下,制备的固定胰蛋白酶具有较好的底物亲和性和酶促反应速率,同时具有良好的可逆性、重复使用性和稳定性。将制备的固定胰蛋白酶用于不同实际样品蛋白质酶切研究,具有酶切速度快、酶切效率高等优异性能,为制备重复使用好、经济价值高的酶促反应体系提供参考。(2)基于DDI技术,以碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶(HRP)和胰蛋白酶为模型酶,在温和的条件下,利用DNA链置换反应成功在功能化磁性粒子表面实现多酶连续固定和目标酶的连续释放,与强碱和高温解旋DNA双链释放目标酶相比,可以显著保留酶活性。同时发现通过DNA链置换反应制备的固定化酶具有较好的底物亲和性、酶促反应活性、稳定性以及重复使用性等优异性能。将制备的固定胰蛋白酶用于蛋白质酶切分析研究,在较短的时间内具有较高的酶切效率。本研究为在同一载体上进行多酶连续固定提供一种新途径。(3)基于前期研究工作,进一步改变磁球表面改性方式,采用带有功能化基团的两性离子试剂对磁球表面进行改性,通过DDI技术将葡萄糖氧化酶(GOx)和HRP固定在磁球表面。采用两性离子试剂进行修饰,不仅引入氨基、磷酸根和巯基功能化基团,便于目标DNA或酶进行连接,而且可以在磁球表面形成水合层,降低非特异性吸附酶对固定化酶体系的影响。实验发现,不同比例的两性离子对磁球表面电荷、酶活性以及酶非特异性吸附量具有显著影响。与自由酶和非特异性吸附酶相比,制备的固定化双酶可以显著增强双酶的级联催化效率和具有较好的动力学参数,同时表现出较好的稳定性和重复使用性。将制备的固定双酶用于葡萄糖检测,具有较好的灵敏度和选择性。这种固定化策略为设计和制备抑制非特异性蛋白质吸附研究装置且高性能的固定化双酶反应器提供了一种新方法。(4)基于DDI技术和磁球,改变固定化酶策略,以制备的生物素功能化的DNA超分子结构为单体,在链霉亲和素的作用下通过自组装方式实现GOx、HRP和磁性纳米粒子封装,制备新型的磁性DNA水凝胶封装酶体系,并将其用于实际样品中葡萄糖浓度的检测。与传统的水凝胶封装酶相比,制备的磁性DNA水凝胶封装酶在磁场控制下易于从反应体系中分离回收,同时可以较好地抑制酶及磁性纳米粒子泄漏。由于双酶具有较好的邻近性和外层DNA保护作用,制备的封装酶展现出较好的级联反应效率、动力学参数以及较好的稳定性和重复使用性。将制备的封装酶分别用于缓冲溶液中和人血清中葡萄糖检测,具有检测限低、选择性好且线性范围宽等优势。本研究为设计和制备强可控性的DNA封装酶提供了一种新途径。(5)基于以上研究基础,进一步改变酶固定化策略,采用ZIF-8金属有机骨架材料(MOFs)为封装酶载体,利用Y-型DNA脚手架对GOx和HRP双酶进行交联,随后封装到ZIF-8中制备封装双酶体系。与传统MOFs封装酶相比,制备的封装酶可以显著抑制酶从MOFs中泄漏,较好地保持封装酶的整体酶促稳定性。同时Y-型DNA脚手架的交联使得双酶具有较好的邻近性和共域化效果,与自由酶和未经DNA脚手架交联的封装酶相比,制备的封装双酶具有较好的底物亲和性和较高的酶促活性。由于外部MOFs的保护作用,制备的封装酶具有良好的稳定性和重复使用性。此固定化策略为设计和制备可显著抑制酶泄漏且具有较好酶促性能的封装酶体系提供了参考。