背景与目的急性髓细胞白血病(AML)是成年人常见的血液系统恶性肿瘤之一,目前白血病的治疗仍以化疗为主。尽管联合化疗已明显延长了患者的生存期,但是对于难治复发的患者疗效提高不明显。因此寻找新的有效药物联合化疗延长难治复发的患者的生存期具有重要意义。表观遗传学是在不改变DNA序列的前提下改变基因的表达或表型。表观遗传学调控包括DNA甲基化,组蛋白修饰,microRNAs和其他小RNA调控,通过表观遗传的异常调节使癌细胞改变了正常的细胞进程保证其存活和增殖优势。急性髓系白血病(AML)具有大量的表观遗传学异常改变,因此也为我们研究表观遗传学对调控AML的治疗作用提供了研究基础。不断进展的研究表明表观遗传对控制细胞的全能性、谱系选择和造血细胞的分化具有重要意义。基因的表观遗传学改变,特别是DNA和组蛋白的甲基化通常伴随基因突变和抑癌基因的沉默,这对细胞产生和维持生物学转变非常重要,包括急性白血病细胞。目前为止表观遗传学研究的最多的是DNA的甲基化,1987年既有在AML中降血钙素5’端调控区域异常甲基化的报道。P15启动子甲基化在成人及儿童几乎所有的形态学类型的白血病中都有中发生,而在正常细胞及髓系祖细胞中没有发现。P15启动子的甲基化与7q-、治疗相关的MDS及AML的不良预后相关。Ying Jiang在MDS向AML转化的研究中发现,在早期MDS中平均只有79个基因位点异常甲基化,而在RAEB/AML中有179个基因位点的异常甲基化。Wnt通路在白血病的发病过程中起重要作用,并且是AML干细胞中的重要通路。Wnt通路的活性受分泌型抑制剂frizzled-related protein (sFRP)家族、Dickkopf (DKK)家族调控。sFRP及DKK家族的异常甲基化在4个AML细胞株Kasumi-1、KG1-α、HL-60、THP1及64%的初发病人中都有发现。Hedgehog通路与细胞的分化、增殖、组织的极化、干细胞的维持及癌变其重要作用。在基底细胞癌、胃癌中SHH、PATH1启动子的甲基化化对hedgehog通路的活性调控起重要作用。此外,表观遗传学调控因子的突变对表观遗传学调控机制的研究也有重要的意义。例如IDH1、IDH2突变在MDS、MPN(慢性期5%,进展期20%)继发性AML(15%-30%)中均有出现。Polycomb家族可以绑定染色质,对基因的表达进行表观遗传学调控。EZH2、SUZ12和EED组成PRC2(polycomb repressive complex2),可以催化组蛋白H327号赖氨酸3甲基化(H3K27me3),并且可以招募其他的PRCs、HDACs、甲基转移酶到染色质的目标位置起相应的抑制基因表达的作用。其中EZH2是PRC2的活性部分,其过度表达是多种实体肿瘤的进展的标志,包括前列腺癌和乳腺癌。在MDS、MPN或MDS/MPN中EZH2失活性突变被认为是预后不良的标志,具体机制还需进一步研究。地西他滨(DAC)是一种DNA甲基转移酶抑制剂,是治疗恶性肿瘤的一种新的表观遗传学调控药物。为难治性AML的去甲基化治疗提供了一种新的选择。小檗碱(BBR)存在于小檗属植物黄柏、黄连和三颗针中,属于异喹啉衍生物类生物碱,是一种季铵化合物。具有广泛的生物学作用,可以抗炎,抗肿瘤。然而BBR的具体生物学机制仍未完全阐明。本课题组前期用基因芯片的方法研究LBH589、硼替佐米联合或单药处理,逆转HL-60/ADR细胞株耐药前后基因表达谱的差异发现表观遗传调控的异常在逆转耐药的信号网络中占有核心的位置。并且在本课题组前期研究显示小檗碱可以抑制骨髓瘤细胞株U266细胞的生长,使其细胞周期停滞,并且诱导ROS通路的激活及IL6分泌。通过生物信息学分析发现BBR具有表观遗传学调控的作用。用BBR处理U266细胞株后用基因表达谱芯片检测发现与PRC1/2相关的基因明显富集。用Reverse-docking的方法发现BBR的可能的靶点是赖氨酸甲基转移酶。在U266细胞株中我们用PCRarray, RT-PCR及western blotting的方法在多个层面验证了生物信息学分析及基因芯片的结果。结果证实BBR对骨髓瘤细胞株U266具有表观遗传学调控作用。鉴于以上的研究结果,本实验的研究旨在：1.通过基因芯片检测和生物信息学深度分析的方法了解HL-60/ADR和HL-60细胞基因表达谱的差异,及其耐药的机制；2.探索BBR对耐药的AML细胞的生物学及表观遗传学调控作用。材料和方法1.细胞株和相关试剂Kasumi-1细胞为中山医科大学第三附属医院刘强教授赠予,HL-60/ADR白血病多药耐药细胞株购自中国医学科学院血液学研究所,HL-60和KGl-α细胞株来自中国科学院生命科学研究院细胞资源中心。Kasumi-1细胞培养在含有20%胎牛血清的1640培养基中,HL-60和KG1-α细胞株培养在含有10%胎牛的1640培养基中。置于37℃,5%C02的细胞孵箱培养。2.基因芯片检测HL-60/ADR细胞和HL-60细胞基因表达谱的差异Trizol法提取HL-60/ADR细胞和HL-60细胞总RNA,对totalRNA进行质量检测。质检合格后使用含有T7的oligo(dT)引物逆转录含有T7启动子的cDNA第一链。以第一链cDNA为模板,合成第二链DNA,形成双链DNA。用双链DNA为模板合成多拷贝aRNA并进行生物素标记,这一步为扩增步骤。纯化aRNA提高其稳定性,并将其片段化。在Affymetrix芯片检测系统条件下,应用U133人类基因组芯片杂交,分析用药前后基因表达谱的差异,差异基因定义为基因表达值倍数变化(fold change)相差达到2倍。并对结果进行聚类分析、功能富集分析、信号转导通路分析及调节网络图谱的构建。3.MTS (promega, America)方法测细胞的增殖抑制取对数生长期的细胞,调整细胞浓度为105/ml,100μl/孔接种于96孔板,置入37℃孵箱2h。加入不同浓度DAC(0.5、1、2μM)、BBR (1、2、4、8、16、32μμM)单药或联合处理HL-60/ADR细胞、KG1-α细胞,并设立空白对照组,加入药物后终体积为200μl。继续培养细胞44h和68h,加入MTS20μμ1/孔培养4h后轻震荡混匀,酶标仪测490nm OD值(A)。细胞增殖抑制率计算：细胞增殖抑制率(%)=[1-(A处理组—A调零孔/A对照组—A调零孔)]×100%。4.流式细胞仪检测细胞凋亡、分化、ADM摄取率用流式细胞仪检测BBR及DAC处理后细胞的凋亡,标记染料为AnnexinV-FITC/PI (KeyGEN)。BBR及DAC处理后的细胞标记CD11b、CD34、 CD38(BD)后流式细胞检测细胞膜表面的表达。0.5μg/ml的ADM处理不同分组的细胞1h,流式细胞仪检测细胞内ADM摄取率。5.RNA的提取用11、22μM的BBR处理细胞48h,1μμM的DAC处理细胞72h。用Trizol (Invitrogen, USA)裂解细胞,按照实验说明书进行总RNA的提取。RNA的纯度用NanoDrop ND-1000检测A260/A280确定。RNA的完整性检测使用1.5%凝胶电泳检测。6. Real-time PCRPCR反应按TAKARA公司SYBR Premix Ex Taq试剂盒说明书进行。总体系20u1。循环条件：95℃15秒变性,60℃34秒退火延伸,共40个循环；在7500荧光定量PCR仪扩增仪上进行实时定量PCR操作。每个标本均做3个平行管,取平均Ct值计算2-△△CT值作为标本目的nRNA的相对表达量。不同时间点预留细胞重复3次。ACT=(CT目的基因-CTβ-actin基因)。每次PCR均做空白对照。结果用2-△△CT表示。7. Western blotting按照上述相同的浓度BBR及DAC处理HL-60/ADR和KG1-α细胞,提取细胞浆蛋白、细胞核蛋白、细胞总蛋白。蛋白浓度用BCA的方法检测。所用的抗体如下：H3K27me3单克隆抗体(CST, No.9733), Histone3单克隆抗体(CST,No.3377),EZH2单克隆抗体(CST,No.5246),DNMT1单克隆抗体(CST,No.5032), β-catenin单克隆抗体(CST,No.8480), GAPDH单克隆抗体(CST,No.5174)。8.甲基化特异性PCR提取各组细胞DNA然后用焦磷酸盐标记DNA。用焦磷酸盐标记好的DNA作为模板,进行PCR扩增。扩增产物用2%的凝胶电泳,UV下观测产物条带。9.统计方法每次试验均设3个复孔,每次试验至少重复3次。试验结果用均数+/-标准差表示。用SPSS13.0进行统计分析。组间的差异用one-way analysis of variance (ANOVA)进行分析,方差齐时用LSD test,方差不齐时用Dunnett’s T3test方法检测,细胞对不同药物及不同时间点的增殖抑制分析使用析因设计的方差分析。P<0.05定义为有统计学差异。结果1.基因芯片分析HL-60/ADR耐药机制通过基因表达谱的差异分析发现HL-60/ADR耐药机制涉及多条信号转导通路的调控异常,如Wnt、hedgehog、PI3K/AKT通路等。并且结果显示表观遗传学相关的蛋白在整个通路的调控中起到核心的作用。2.BBR和DAC的增殖抑制和诱导凋亡作用MTS法检测细胞增殖抑制率结果显示：BBR和DAC对HL-60/ADR, HL-60、KG1-α细胞抑制效应显示出剂量时间依赖性,即随药物剂量增加时间的增长增殖抑制作用显著增强。小檗碱(BBR)对HL-60、HL-60/ADR细胞都具有明显的增殖抑制作用,其48小时、72小时、96小时的IC50分别为7μM、22μM,1.3μM、13.5μM,1.6μM、18.μN。同样的浓度对KG1-α细胞增值抑制作用明显减弱。DAC对不同细胞株的的增殖抑制作用差异较大,0.5、1、2μM的DAC对HL-60细胞具有明显的增殖抑制作用,对KG1-α及Kasumi-1增殖抑制作用较弱,对HL-60/ADR无明显的增殖抑制作用。DAC可诱导Kasumi-1细胞凋亡,对HL-60/ADR田胞无明显的诱导凋亡的作用。3.细胞分化检测及细胞周期瑞士染色的方法检测DAC. BBR处理HL-60/ADR, KG1-α后细胞形态的变化,结果提示DAC可以明显诱导细胞成熟,细胞胞浆增多,细胞核凹陷,BBR处理后细胞体积变小,无明显分化成熟的表现。流式细胞仪检测DAC处理后的细胞发现CDllb表达明显增高,BBR处理后CDllb无明显变化。DAC1μM处理细胞后,细胞周期无明显改变,10μM DAC处理细胞后,细胞周期呈G0/G1期细胞减少,G2/M期细胞增多。HL-60/ADR细胞G0/G1期细胞由25.8%(25.8±2.09)降至16.5%(16.5±1.21),G2/M期细胞由39.2%(39.2±8.15)升至56.3%(56.3±3.40)。KGl-α细胞G0/G1期细胞由13.6%(13.6±1.04)降至10.4%(10.4±1.95),G2/M期细胞由25.9%(25.9±0.95)升至30.3%(30.3±0.98)。4.细胞耐药逆转的检测0.5、1、2μM DAC和11、22μMBBR处理后HL-60/ADR细胞ADM摄取率分别为3.4%、8.6%,15.7%,17.4%和39%、30%。结果表明两种药物处理后细胞ADM摄取率明显提高(P>0.01)。用不同浓度(0.5、1、2gM)的DAC处理细胞72h后,检测不同浓度的ADM对HL-60/ADR和Kasumi-1细胞的增殖抑制率,结果表明处理组和对照组无明显差异。5.定量PCR检测表观遗传学相关基因表达用11、22μM的BBR处理HL-60/ADR和KG1-α细胞株48h后,组蛋白乙酰转移酶EP300和CREBBP上调,同样上调的还有组蛋白脱乙酰化酶SIRT3、组蛋白脱甲基酶KDM6A.组蛋白甲基转移酶SETD7、WHSC1I,下调的有组蛋白甲基转移酶WHSC1Ⅱ和SMYD3。但是组蛋白乙酰化酶HDAC8没有明显的改变。6. BBR、DAC处理后H3K27me3、EZH2、DNMT1、β-catenin蛋白的变化分别用BBR11、22μM处理HL-60/ADR和KG1-a细胞株48h,细胞核H3K27me3蛋白水平明显降低,随着浓度的增大蛋白降低更加明显,同时降低的还有细胞核内的β-catenin蛋白,而胞浆的β-catenin蛋白无明显变化。细胞总的EZH2、DNMT1蛋白也随着BBR浓度的增大而降低。DAC1μM处理细胞72h,细胞DNMT1蛋白降低,EZH2蛋白无明显变化,细胞核内β-catenin蛋白减少。7.甲基化特异性PCR (MSP)检测SFRPs基因甲基化的改变提取对照组和DAC、BBR处理组的DNA,然后焦磷酸盐标记非甲基化的碱基,而甲基化的甲基不能被焦磷酸盐标记。BBR11、22μM可以降低SFRP1/2/5基因的甲基化水平,并且随着浓度的增加,去甲基化作用更加明显。DAC1μM可以明显降低SFRPs的甲基化。结论：1.表观遗传学调控的异常对AML的耐药有重要的作用,这其中包括组蛋白甲基化的异常及DNA的高度甲基化。2.BBR对HL-60/ADR、HL-60、KG1-α细胞具有抑制增殖作用,其抑制作用效果随着时间和剂量的增加而增强。DAC可以明显抑制HL-60细胞增殖,对其他细胞作用较弱。3.DAC可以增加HL-60/ADR、KG1-α细胞CD11b的表达,促进细胞的分化。4.BBR可以降低细胞EZH2、DNMT1蛋白的表达,同时降低细胞核内H3K27me3的蛋白表达。5.BBR、DAC可以通过降低SFRPs的甲基化水平而抑制Wnt通路的活性。