哺乳动物的卵泡发育过程受到内分泌、旁分泌以及基因的调控,这一过程会受到来自组织内细胞产生的DNA损伤以及外界环境造成的DNA损伤影响。有文献报道范可尼贫血(Fanconi anemia,FA)基因在卵泡发育成熟过程中发挥DNA链间交联损伤修复的功能。范可尼贫血是一种罕见的常染色体或X染色体连锁的隐性遗传病,其主要源于FA基因的突变。近年研究发现FA通路通过识别体内DNA损伤启动同源重组修复,对维持基因组和染色体稳定十分重要。FA致病基因携带患者常常伴有骨髓衰竭、先天性发育异常、高度致癌性等特征,女性FA患者常伴有早发性卵巢功能衰退(premature ovarian insufficiency,POI)症状,因FA致病基因携带患者临床症状呈多样性、异质性,因此其详细病因尚不清楚。目前已有文献报道FA基因在卵泡发育过程中的作用主要表现在以下方面:促进PGCs增生;抑制减数分裂联会交叉形成、促进同源重组修复;维持染色体结构的稳定。而卵母细胞成熟过程受到众多因素的调控,经历一系列形态和生态变化。但是有关FA通路在卵母细胞成熟过程中的作用还没有确切报道。FA基因是否影响卵泡发育成熟仍然值得进一步探讨。为了探索FA通路异常在雌性小鼠卵母细胞发育成熟中的影响,我们在体外实验中借助USP1去泛素化酶抑制剂SJB3-019A抑制USP1活性。实验结果提示在卵母细胞培养液中添加USP1抑制剂后不影响卵母细胞成熟,但是卵母细胞内转录转座子的表达水平均出现上调。这些转录转座子表达水平的异常上调将可能引起基因组的不稳定性,易发生突变和异常重组。利用免疫荧光检测USP1抑制剂处理后卵母细胞纺锤体的形态变化和染色体变化,我们发现抑制剂处理组中出现了各种形态异常的纺锤体和排列紊乱的染色体。异常纺锤体主要为极体异常,包括无极体,单极体,多极体等;其他纺锤体异常为未组装好以及拉长或者缩短的纺锤体。染色体异常则表现为排列紊乱。因此我们推测利用USP1抑制剂导致DNA修复异常后会影响小鼠卵母细胞减数分裂成熟过程中纺锤体组装、纺锤体稳定性。这些基因组不稳定将会对卵母细胞的体外受精能力造成影响,IVM(in vitro maturation)后体外受精结果也表明DNA修复通路异常导致小鼠卵母细胞受精率降低,和我们的推论相符合。除体外实验外,我们也尝试通过体内实验阐释FA通路中重要基因的功能,我们首先借助BIOGPS网页分析了FA通路中一些重要基因在卵母细胞和早期胚胎中的表达情况,经过对比我们发现Ube2t作为FA通路中的E2泛素结合酶,在卵母细胞中表达较为特异,进一步检索我们发现UBE2T蛋白在人类和小鼠中同源性较高,借助小鼠模型作为研究工具研究UBE2T蛋白在人类中的作用具有一定参考意义。对小鼠多组织/细胞的realtime-PCR结果分析显示Ube2t mRNA在GV期卵母细胞、MII期卵母细胞以及受精卵中高表达,在卵裂后表达水平下降。UBE2T蛋白免疫荧光结果提示该蛋白表达于小鼠GV期和MII期卵母细胞,并在受精卵和早期胚胎中持续表达并且表达水平未见明显变化,提示UBE2T可能作为一个潜在的母源效应蛋白在卵母细胞和早期胚胎发育过程中发挥重要作用。接下来我们利用CRISPR-Cas9的方法构建设计了针对Ube2t单一导向的RNA(Single-guide RNA,sgRNA),通过与Cas9 mRNA共显微注射,分别得到两个Ube2t发生移码突变的基因失活品系。小鼠基因测序分析结果显示我们成功构建了Ube2t基因移码突变的基因敲除鼠,并且这些突变能够稳定地遗传给子代。在该小鼠保种和繁殖的过程中,我们发现敲除小鼠出生的子代纯合数目极低,纯合得率约为3.9%(9/228),严重不符合孟德尔遗传定律,我们猜测部分纯合小鼠在胚胎时期致死,对4.5dpc,6.5dpc和10.5dpc的小鼠组织测序结果分析,我们初步推测纯合小鼠胚胎致死时间点可能在4.5dpc-6.5dpc之间。对部分得到的纯合小鼠进行生殖力测试,测试结果表明Ube2t基因敲除的小鼠和对照组小鼠相比雌性小鼠和雄性小鼠都表现为生育力缺失,并且出现眼睑部、啮齿和等的发育异常。对Ube2t基因敲除的纯合小鼠进一步研究发现,雌性纯合小鼠出现不同程度的卵泡数目缺失以及生殖系统萎缩。通过检测DNA损伤(double-strand damage,DSB)的荧光标记物γ-H2AX信号,我们发现在雌性纯合小鼠卵巢内存在大量的DNA损伤位点。我们推测UBE2T蛋白缺失造成FA通路修复功能障碍,从而使小鼠卵巢内保留的卵母细胞易受内/外源性物质的影响,引起DSB的增加聚积,加速卵巢衰老或者萎缩。