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研究背景三氯乙烯(Trichloroethylene,TCE)是一种常见的工业材料,由于其出色的去污性能,而被广泛用于电子零件的脱脂和清洁。由于TCE分子量小且具有亲脂性,一旦暴露,便会迅速吸收并分布于全身。职业接触TCE的工人会发展为全身性过敏性疾病,主要临床表现类似于严重的药物过敏。这种由TCE暴露引起的职业性皮肤病被定义为三氯乙烯药疹样皮炎(Occupational medicamentosa-like dermatitis due to trichloroethylene,OMLDT)。OMLDT是一种以特发性全身性皮肤疾病且伴有多器官损伤为特征的常见综合征,在全球范围内引起越来越多的公共卫生关注。免疫性肾损伤是OMLDT的常见并发症。以往研究发现补体攻膜复合物C5b-9主要沉积于TCE致敏所致的受损肾小管,但其具体作用机制尚不明确。内吞受体megalin和cubilin主要表达于近端肾小管刷状缘,是肾小管发挥尿蛋白重吸收作用的关键分子,与多种肾脏疾病的发生发展密切相关。目前,内吞受体是否参与TCE所致免疫性肾损伤还不清楚。研究目的本研究主要为探讨以下科学问题:在TCE所致免疫性肾小管受损过程中,攻膜复合物C5b-9是否通过调控肾小管上皮细胞表面内吞受体megalin和cubilin的表达,介导肾小管尿蛋白重吸收功能障碍。研究方法采用整体动物实验探讨C5b-9调控megalin/cubilin介导的尿蛋白重吸收障碍:建立TCE致敏BALB/c小鼠模型,收集不同组别小鼠生物材料,包括外周血、尿液以及肾脏的分离与保存。通过对实验小鼠使用C5b-9抑制剂CD59预处理与否,采用苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin,HE)染色、过碘酸-希夫(Periodic acid-schiff,PAS)染色和尿蛋白生化检测确定肾小管损伤;利用免疫组化评估小鼠肾脏中C5b-9和CD59的表达水平,并结合免疫荧光双标进一步确定C5b-9的表达部位;通过定量即时聚合酶链锁反应(Quantitative real time polymerase chain reaction,q RT-PCR)评估megalin和cubilin m RNA的表达水平。采用体外实验鉴定C5b-9亚裂解水平:通过分离近端小管上皮细胞,采用LDH实验计算近端小管上皮细胞中死亡细胞所占比例进一步评判C5b-9的亚裂解效应。研究结果1.小鼠致敏率建立TCE经皮致敏BALB/c小鼠实验模型,本次实验中,TCE处理组和TCE+CD59联合处理组小鼠的致敏率(TCE致敏阳性小鼠数/TCE处理组小鼠总数)分别为35.00%和34.87%。2.TCE致敏引起肾小管结构和功能异常采用HE染色、PAS染色观察各组小鼠的肾脏组织病理学改变,结果发现与对照组相比,TCE致敏阳性组小鼠出现肾小管水肿和结构重排;收集各组小鼠尿液,测定包括白蛋白、α1微球蛋白、β2微球蛋白和视黄醇相关结合蛋白在内的肾小管损伤指标水平变化,发现肾小管重吸收蛋白的能力下降。3.亚裂解的C5b-9沉积于受损肾脏的近端肾小管上皮细胞中利用免疫荧光双标对C5b-9和近端肾小管上皮细胞标志物megalin进行共定位检测,结果发现C5b-9主要沉积在近端肾小管上皮细胞;进一步分离提取TCE致敏各组小鼠的近端肾小管上皮细胞,并对其进行鉴定,采用乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒检测死亡细胞比例,结果显示TCE致敏阳性组小鼠肾小管上皮细胞死亡细胞小于5%,提示C5b-9发挥的是亚裂解效应。4.外源CD59能够有效抑制近端肾小管中C5b-9的沉积采用免疫组化法检测肾小管中C5b-9和CD59的沉积情况,通过比较各组间C5b-9和CD59的相对表达情况,可以发现TCE+CD59致敏阳性组中CD59在肾小管大量聚集,而其余各组CD59的表达并无统计学差异,而使用外源性CD59预处理后发现TCE+CD59致敏阳性组中C5b-9沉积明显减少,CD59有效地抑制了C5b-9在肾小管的组装。5.抑制C5b-9的沉积可纠正受损的肾脏中megalin和cubilin的表达采用免疫荧光和q RT-PCR检测各组中内吞受体megalin和cubilin的蛋白和m RNA表达情况,观察抑制C5b-9对肾脏内吞受体及其转运蛋白能力的影响。研究发现相比于溶剂对照组,TCE致敏阳性组小鼠肾脏中内吞受体的蛋白和m RNA水平明显降低,抑制C5b-9后,与TCE致敏阳性组相比,TCE+CD59致敏阳性组小鼠体内内吞受体的蛋白和m RNA表达恢复。6.抑制C5b-9可增强肾小管对尿蛋白的重吸收采用HE染色、PAS染色观察施用外源性s CD59-Cys重组蛋白后肾小管结构受损的恢复情况,结果显示TCE+CD59致敏阳性组小鼠肾小管细胞水肿减轻、基底膜增厚情况明显改善。通过检测尿液中微量蛋白的含量评估肾小管重吸收功能受损程度,结果发现TCE+CD59致敏阳性组尿液中微量蛋白含量都有不同程度的降低,提示肾脏重吸收小分子蛋白质的功能明显有所恢复。结论TCE致敏诱导的肾小管损伤中,亚裂解C5b-9通过下调内吞受体megalin和cubilin的表达抑制肾小管重吸收功能。