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壳寡糖是壳聚糖的降解产物,其水溶性好,易吸收,能抗菌、抗肿瘤、提高机体免疫力。壳寡糖激活如巨噬细胞、脾脏T淋巴细胞等免疫细胞,活化的免疫细胞不仅产生活性氧、活性氮等活性物质,还能分泌细胞因子。相关研究表明,投喂壳寡糖可以增强鱼类的免疫应答及抗感染能力,但其具体的作用机制尚不清楚。因此,本研究通过体内和体外两种实验方法,以壳寡糖作为免疫刺激剂探究其对团头鲂头肾巨噬细胞免疫功能的影响。主要的研究结果如下:1通过团头鲂头肾巨噬细胞的分离、纯化、鉴定,获得了纯度超过98%的团头鲂头肾巨噬细胞。2壳寡糖刺激巨噬细胞,吞噬含有GFP的大肠杆菌,通过荧光显微镜观察和酶标仪检测壳寡糖组比对照组吞噬细菌数显著增强,产生活性氧、活性氮、i NOS酶活显著增强。一氧化氮合酶的m RNA及NADPH氧化酶五个亚基(p91phox、p22phox、p40phox、p47phox、p67phox)m RNA水平与对照组相比显著提高。3投喂1%壳寡糖一周,投喂组分离的巨噬细胞产生活性氧、活性氮及IL-1βm RNA、TNF-αm RNA水平与对照组相比显著性增强。4克隆团头鲂一氧化氮合酶(i NOS)基因的全长序列(Genbank accession NO:KJ668755)全长4215bp,5’UTR为197 bp,3’UTR为775 bp,开放阅读框(ORF)为3243 bp,编码1080 aa。3’末端具有典型的加尾信号AATAAA和Poly A尾巴。TMpred软件分析显示i NOS具有3个分别由28、25、21个氨基酸组成的跨膜区,氨基酸结构预测显示i NOS不存在信号肽序列,包含4个主要的结构域,即NO synthase结构域(位置在80-451);flavodoxin 1结构域(490-621);FAD结合域(670-897);NAD结合域(929-1043)。还包括十分保守的血红素、钙调蛋白、四氢生物蝶呤、FAD、FMN、和NADH等辅因子的结合位点。结果表明:壳寡糖能够提高巨噬细胞对细菌的吞噬能力,增强非特异性免疫应答。被激活的巨噬细胞产生和分泌更多的活性氧、活性氮及细胞因子IL-1β、TNF-α,激活机体的特异性免疫功能。