茯茶(Poria cocos)又名茯莵、茯灵、松茯茶等,是药食同用真菌的一种,其活性成分主要有:多糖、皂苷、生物碱、多酚类以及萜类等物质。茯茶多糖(Pachyman,PHY)作为一种真菌多糖,主要成分是β-(1→3)-D-葡聚糖,大多分布在茯苓的子实体、菌丝及其发酵液中,具有多种生物活性,如:抗肿瘤、免疫调节、保肝作用等。然而,茯茶多糖存在着大分子多糖普遍存在的缺陷,即在体内代谢快,作用时间短,作用范围不集中,临床用量大等,若直接应用于临床,会导致副作用增强。因此,解决这一问题成为必要。聚乳酸(Poly lactic acid)是一种新型可生物降解的高分子材料,具有较好的生物相容性,无刺激性、无毒,在人体内通过水解生成乳酸单体,然后被氧化成丙酮酸,经过三羧酸循环,最终生成水和二氧化破从人体排出。一些临床上采用肠道外给药途径的药物,如:肽类、蛋白类、酶类、疫苗等,往往易被分解破坏,通过被PLA纳米粒包裹,可以避免分解,并能够有效控制药物在体内的降解速度。本论文首先采用复乳法,制备了茯茶多糖聚乳酸纳米粒(PHYencapsulatedPLAnanospheres,PHYP),采用响应面法优化了茯苓多糖聚乳酸纳米粒的最佳制备条件,研究了一系列茯苓多糖聚乳酸纳米粒的表征特点,并在体外和体内研究了茯苓多糖聚乳酸纳米粒的免疫增强活性。试验分为以下四个部分:实验Ⅰ 茯茶多精聚乳酸纳米粒的制备及制备条件的优化采用复乳法制备茯苓多糖聚乳酸纳米粒。以PHYP的包封率和载药量为指标,考察了 F68浓度(w/v)、PLA浓度(mg·mL-1)、PHY与PLA比值(W1/o)、PLA与外水相比值(o/w2)4个单因素对PHYP制备的影响。发现F68浓度(w/v)、PLA浓度(mg·mL-1)和PHY与PLA比值(w1/o)3个因素对PHYP的包封率和载药量影响较大。在单因素试验的基础上,采用响应面分析法研究了 F68浓度(w/v)、PLA浓度(mg·mL-1)和PHY与PLA比值(w1/o)3个因素对PHYP包封率的影响。由Design-Expert软件进行数据分析,调整后得到PHYP最佳制备条件组合:F68浓度为0.33%,PLA浓度为30mg·mL-1,PHY与PLA比值为10.25:1。根据最佳制备条件组合进行验证性试验,所得茯苓多糖聚乳酸纳米粒包封率为58.21±0.56%。PHYP经过处理,通过DLS测得纳米粒粒径为258.1±3.76nm,在透射电镜下观察纳米粒的形态,发现PHYP呈球形,表面光滑,大小均一。用透析法对纳米粒和单独PHY进行药物释放的考察,结果发现在同样的条件下,PHY在最初的几个小时内大部分释放完毕,PHYP在经历了突释阶段后,接下来的几天缓慢释放,最后达到顶峰。考察了 PHYP纳米粒在不同介质中的稳定性,结果发现纳米粒在含有血清的介质中比在不含血清的介质中稳定性低。试验Ⅱ 茯茶多糖聚乳酸纳米粒体外对小鼠淋巴细胞增殖的影响为了考察PHYP体外对小鼠淋巴细胞增殖的影响,本试验首先测定了脾脏淋巴细胞生长在PHYP和PHY刺激下的最大安全浓度;然后分别取最大安全浓度以下的5个浓度,在单独或协同PHA、LPS的情况下,体外与小鼠脾脏淋巴细胞共培养48 h,考察淋巴细胞的增殖情况;最后,取PHYP和PHY最大安全浓度之下的三个浓度,与分离的淋巴细胞单细胞悬液共培养,48 h后通过流式细胞仪检测结果。结果发现,PHYP最大安全浓度低于PHY;在浓度为31.25 μg·mL-1时,PHYP单独刺激淋巴细胞增殖的效果最明显(P<0.05),浓度为62.5 μg·mL-1时,PHYP协同PHA刺激T淋巴细胞增殖的作用最强,浓度为7.813 μg·mL-1时,PHYP协同LPS对B淋巴细胞增殖的刺激效果最好;在浓度范围为62.5-3.906 μg·mL-1时,PHYP、PHY和PLA均能刺激淋巴细胞增殖,且PHYP对淋巴细胞增殖的刺激均优于PHY和PLA;PHYP中浓度组对淋巴细胞CD4/CD8表型的比例最高,并显著高于多糖PHY组。试验Ⅲ 茯苓多糖聚乳酸纳米粒体外对树突状细胞促成熟作用为了研究茯茶多糖聚乳酸纳米粒对小鼠骨髓源树突状细胞功能的影响,本试验考察PHYP体外对骨髓源树突状细胞表面分子表达的影响,以及树突状细胞对抗原和PHYP的吞噬作用。在考察BMDC表面共刺激分子的表达时,小鼠骨髓单核细胞经收集、诱导、隔天换液,体外培养7天后分别加入最大安全下浓度的PHYP、PHY和PLA纳米粒,共培养24 h后,通过与CD86、CD80抗体共孵育,利用流式细胞仪考察PHYP对骨髓源树突状细胞表面共刺激分子的表达情况;通过对细胞核染色处理,在激光共聚焦显微镜下可以观察到在药物的刺激下,BMDC对连接荧光染料的抗原摄取的影响;通过对细胞进行超薄切片处理,利用透射电镜TEM证明BMDC对纳米粒的吞噬作用。结果表明,与其他对照组相比,PHYP对于树突状细胞表面共刺激分子CD86和CD80的表达量显著增加;同时激光共聚焦的结果证明了在PHYP的刺激下,BMDC对抗原的摄取量明显增加;最后透射电镜的图片证明了 BMDC对PHYP的吞噬作用,说明纳米粒是通过被细胞摄取后刺激树突状细胞的分化与成熟。试验Ⅳ 茯苓多糖聚乳酸纳米粒对OVA抗原特异性免疫应答的影响为了探索茯苓多糖聚乳酸纳米粒体内对OVA免疫小鼠的免疫应答作用,本试验将90只4-6周龄BALB/c小鼠随机分为6组,每组15只,以皮下免疫的方式,第0天免疫第一次,第14天免疫第二次。在第二次免疫后连续四周分别通过摘眼球法采取小鼠血液,分离血清,测定血清中OVA特异性IgG抗体的浓度,以及IgG1和IgG2a的含量;在第二次免疫后的第7(D21)、14(D28)、35(D49)天,培养分离得到的淋巴细胞,考察淋巴细胞增殖情况,同时利用流式细胞仪检测T淋巴细胞活化情况,并在第28天(D28),使用ELISA法检测细胞上清中细胞因子IFN-γγ、IL-2、IL-4和IL-6的水平;于免疫后的24h,分离小鼠的下颌淋巴结和腹股沟淋巴结,考察PHYP对淋巴结中树突状细胞表面分子CD86、CD80以及MHC Ⅱ的表达和成熟影响。试验表明,较其他对照组,OVA-PHYP可显著促进血清中OVA特异性抗体的产生,刺激小鼠脾细胞中细胞因子的分泌,提高小鼠脾脏淋巴细胞的增殖率,引起的更多CD3+ CD4+、CD3+CD8+淋巴细胞的活化,显著促进淋巴结树突状细胞表面分子CD86、CD80以及MHCⅡ的表达、成熟。